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目的 诱骗受体3(Decoy receptor 3,DcR3)是诱骗受体家族(DcR1,DcR2,DcR3)的成员之一,属于肿瘤坏死因子超家族。研究表明DcR3在神经胶质瘤、胃癌、结直肠癌、胰腺癌等恶性肿瘤中高表达,在其中发挥抑制肿瘤细胞凋亡,促进肿瘤细胞免疫逃逸的作用,但是DcR3调控胰腺癌细胞增殖和侵袭的作用和具体机制尚未完全阐明。在本研究中,我们探讨DcR3在胰腺癌细胞中的功能以及相关调控机制。方法(1)应用免疫组织化学法(IHC)检测64对胰腺癌及配对非癌胰腺组织的表达;应用ELISA对112例胰腺癌患者血清中DcR3的水平进行检测。分析组织标本和血清标本中DcR3表达的相关性。(2)应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),免疫印迹(Western Blot)检测 DcR3 在 5 株胰腺癌细胞株(PATU8988,PL45,CFPAC-1,SW1990,PANC-1)中的表达情况。(3)应用小干扰RNA以及过表达质粒在胰腺癌细胞株中分别下调及上调DcR3,利用细胞transwell实验、划痕实验、平板克隆形成实验及CCK8实验检测DcR3对于胰腺癌细胞增殖和侵袭能力的影响。(4)应用基因芯片技术(Gene Chip),分析对照组及DcR3敲除组的下游差异基因,并验证相关信号通路。(4)利用信号通路功能回补实验,验证STAT1信号通路在DcR3促进胰腺癌细胞增殖和侵袭中的作用。(5)利用生物信息分析技术与基因芯片结果相结合,在网络数据库寻找STAT1的转录因子。应用荧光素酶实验验证转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用。结果(1)胰腺癌组织中DcR3 阳性率为67%(43/64)。非癌胰腺组织DcR3阳性率为28.1%(18/64)。DcR3在胰腺癌组织表达明显高于非癌胰腺组织(χ2=19.5 74,P<0.001)。临床病理因素分析发现DcR3的表达与性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤分化程度无关(P>0.05),;DcR3的表达与胰腺癌肿瘤大小(P=0.040),淋巴结转移(P=0.037),临床分期(P=0.010)相关,差异具有统计学意义。且胰腺癌组织中DcR3的表达与血清中DcR3的表达呈正相关(r=0.3747,P=0.0023)。DcR3高表达组与DcR3低表达组生存时间差异具有统计学意义(Log-rank,P=0.0098)。(2)在5株胰腺癌细胞株中,DcR3的表达在PATU8988细胞中最高,而在PL45细胞中最低。Western blot验证DcR3的转染效率,其表达差异均有统计学意义。细胞功能实验发现DcR3促进胰腺癌细胞的增殖能力和侵袭能力(P<0.05)。(3)基因芯片显示差异表达的基因富集于15个通路,包括JAK/STAT信号通路(hsa04630)(P<0.05)、泌乳素信号通路(hsa04917)(P<0.05)、toll 样受体信号通路(hsa04620)(P<0.05)等。Western blot 结果显示 DcR3促进STAT1的磷酸化,回补实验验证STAT1信号通路参与DcR3促进胰腺癌细胞增殖和侵袭的作用。(4)ChIP结果显示,STAT1与IRF1启动子区P1位点结合,但与启动子区P2位点未结合。双荧光素酶实验进一步证实启动子区中P1的缺失导致荧光素酶活性较野生型载体明显降低(P<0.01),表明被DcR3激活的STAT1可以转录上调IRF1的表达。此外,ChIP和双荧光素酶实验进一步发现IRF1可以转录调控DcR3和CEACAM1的表达。DcR3/STAT1/IRF1通过形成正反馈环增加DcR3的表达,促进胰腺癌细胞增殖和侵袭的能力。结论(1)DcR3在胰腺癌组织中和胰腺癌患者血清中均高表达,且两者表达水平呈正相关;胰腺癌组织中DcR3的表达水平与胰腺癌肿瘤大小、淋巴结转移、临床分期相关。DcR3阴性表达的胰腺癌患者生存时间明显高于DcR3阳性患者。(2)DcR3通过上调STAT1的磷酸化水平促进胰腺癌细胞的增殖能力和侵袭能力。(3)STAT1在胰腺癌细胞中转录上调IRF1的表达,IRF1上调DcR3和CEACAM1的表达,通过形成DcR3/STAT1/IRF1反馈环参与胰腺癌增殖和侵袭。