【摘 要】
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目的G蛋白偶联受体108（GPR108）作为G蛋白偶联受体家族成员之一,其功能和受调控机制尚未明确。该研究旨在寻找GPR108基因启动子,同时探讨其是否与果蝇头状因子3（GRHL3）发生相互作用,进而研究转录因子GRHL3调控GPR108基因表达的分子机制。方法1.通过生物信息学分析公共数据库,获得各种癌症组织的肿瘤细胞中的GRHL3和GPR108的表达水平以及相互关系。2.运用逆转录实时定量PC
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目的G蛋白偶联受体108（GPR108）作为G蛋白偶联受体家族成员之一,其功能和受调控机制尚未明确。该研究旨在寻找GPR108基因启动子,同时探讨其是否与果蝇头状因子3（GRHL3）发生相互作用,进而研究转录因子GRHL3调控GPR108基因表达的分子机制。方法1.通过生物信息学分析公共数据库,获得各种癌症组织的肿瘤细胞中的GRHL3和GPR108的表达水平以及相互关系。2.运用逆转录实时定量PCR（RT-q PCR）检测GRHL3和GPR108基因在人皮肤鳞癌细胞系（A-431）、人肝癌细胞系（Hep G2）以及人神经母细胞瘤细胞系（SH-SY5Y）的表达。3.利用分子克隆技术构建含有GPR108基因启动子的荧光素酶报告基因表达载体p GL3-GPR108-Promoter,通过PCR、限制性核酸内切酶等方法验证该重组载体;并利用PCR方法将表达载体中与GRHL3相结合的潜在位点5’-AACCGGTG-3’进行删除突变,DNA测序方法验证突变结果。4.通过双荧光素酶报告基因检测系统（Luciferase）,观察GRHL3对GPR108基因启动子的调控作用;5.通过染色质免疫共沉淀（Ch IP）实验分析GRHL3和GPR108启动子结合位点之间的关系。结果1.生物信息学分析在各种癌症组织的肿瘤细胞中,GRHL3的表达较低,而GPR108的表达较高。2.利用分子克隆技术成功构建了GPR108基因启动子和突变型GPR108基因启动子荧光素酶报告基因表达载体;3.Luciferase结果表明,GRHL3对荧光素酶报告基因GPR108的启动子具有明显的抑制作用。将GPR108启动子上的结合位点删除突变后,GRHL3对GPR108基因启动子的负调控作用减弱;4.Ch IP结果显示GRHL3能与GPR108启动子结合位点结合。结论1.在人体肿瘤细胞系中,GRHL3的表达水平低于GPR108;2.转录因子GRHL3通过与GPR108基因启动子中的保守序列结合,负调控GPR108基因的表达;3.GPR108基因近端启动子调控区域的特定基序5’-AACCGGTG-3’,是转录因子GRHL3的DNA结合位点,并且还有其他负调控结合位点。
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