目的共价药物与靶蛋白以共价键的形式结合,故具有结合力强、药物有效浓度低、有效作用时间长等优势。随着近几年国内外陆续有多种靶向共价抑制剂（Targeted covalent inhibitors,TCI）例如阿法替尼、依鲁替尼和泽布替尼等获批上市,小分子共价化合物成为了新药开发的重点研究对象。因此,药物化学家们构建了大规模的小分子文库,进而通过繁重的筛选工作,在全蛋白质组范围内挖掘可被小分子药物特异性靶向的活性位点。化学蛋白质组学是目前的主流方法之一,尤其是基于活性的蛋白质组分析方法（Activity-based protein profiling,简称ABPP）及其衍生技术。但无一例外,这些方法很难做到真正意义上的高效鉴定,一般只能以牺牲操作便捷度以及时间为代价,比如通过大规模分馏提升鉴定数目。另一通病是通量有限,不论是样品前处理还是后续的数据分析、靶点筛选均依赖于人工操作,难以实现工业界所需的规模化、自动化。因此,如何在压缩实验耗时的同时提高鉴定量,并串联湿、干实验所有环节,搭建一套全自动化分析流程是目前亟待突破的技术瓶颈。本项目试图以此为目标,在课题组现有平台QTRP的基础上,进行逐级、系统优化,提高化学蛋白质组技术的鉴定量和通量,助力制药界大规模筛选小分子文库,从而高效、精准地识别潜在的药物靶标。方法在ABPP的基础之上,本课题组前期利用商品化的巯基反应性探针IPM共价标记组织细胞中的半胱氨酸残基,开发出一套定量测定巯基蛋白质组对亲电小分子反应性的化学蛋白质组学技术,称之为QTRP（Quantitative Thiol Reactivity Profiling）。在QTRP的基础之上,首先,本工作对其中的繁琐步骤进行简化以提高工作效率。其次,结合其他两种领域内目前常用技术,通过系统评估五种商品化的可切割生物素试剂——在化学蛋白组学流程中“承上启下”的关键试剂,对样品前处理方案进行大幅度优化。最后,借助多通道设备以及改变同位素标记信息引入的时机,提高样品前处理的通量。此外,通过测评六款主流蛋白组学定量软件对化学探针修饰肽段的定量准确度,确定配套的分析软件并搭建批处理数据处理流程。结果1.QTRP流程简化:通过去除繁琐的强阳离子交换步骤（Strong Cation Exchange,简称SCX）,在不影响单次实验鉴定量（数千个半胱氨酸位点）的前提下,将制样时间从四天缩短至三天。2.QTRP流程鉴定性能提升:通过将可切割生物素试剂DADPS应用于流程B（蛋白水平的点击化学反应,肽段水平的亲和富集）,在单次实验可定量半胱氨酸位点数达一万以上的同时,将制样时间从三天缩短至两天。3.QTRP流程通量提升:借助多通道设备并在IPM探针标记时提前引入轻重同位素标签（过去是在点击化学反应时）,将制样时间从两天缩短至一天,即一天可完成至少48个样品的前处理;同时,采用新版p Quant定量软件进行质谱数据解析并在此基础上开发批处理流程,一天可将36个质谱数据自动转换为位点水平的定量信息。4.通量化QTRP流程应用:将该技术应用于鉴定292个小分子化合物的蛋白靶点。结论本工作以实现全自动化共价药物靶标鉴定为目标,初步建立了一套准确高效的通量化共价药物靶标鉴定流程:单个样品即可定量上万个半胱氨酸残基对小分子化合物的反应性,且样品前处理的效率较传统QTRP流程提升了20倍;同时,数据处理实现自动化,并将时间压缩至原先的三分之一。最终,该流程成功应用于大规模药物靶点鉴定。