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禽流感病毒在繁殖、复制过程中会产生大量的非结构蛋白NS1蛋白，但在成熟的病毒颗粒中则没有发现该蛋白，推测感染病毒的鸡群会产生较高水平的NS1抗体，而免疫鸡群的NS1抗体水平应很低或几乎没有，这是本研究建立间接ELISA鉴别诊断的理论依据。 采用重组表达的方式以获得纯化的禽流感NS1蛋白作为包被抗原。提取H9N2型禽流感病毒的RNA，设计针对NS1蛋白的引物，通过套式RT-PCR扩增，得到NS1蛋白的编码DNA。将所得的编码DNA插入pET-32a(+)，构建出能够表达NS1蛋白的载体。将该载体导入到大肠杆菌BL21细胞中测序，在基因库中与其他禽流感病毒的相应序列比较，用IPTG在适当温度和条件下诱导表达，通过测序和Western Blot鉴定所表达的蛋白，并对重组蛋白进行纯化。结果显示，构建的重组载体经测序分析，确定所插入的外源基因为禽流感病毒NS1蛋白基因序列。表达产物经免疫转印，确定所得产物为禽流感NS1蛋白。表达产物经纯化后，可获得1-3mg／mL禽流感NS1融合蛋白。 获得纯化的禽流感NS1蛋白后，以此作为抗原建立间接ELISA。测定抗原最佳包被浓度、抗体最佳稀释浓度，抗原抗体最佳反应时间，酶标二抗最佳稀释倍数，酶标二抗最佳反应时间，并进行了重复性和特异性试验。实验结果为抗原的最佳包被浓度为40μg／mL，抗体的最佳稀释倍数为1：200，抗原抗体最佳反应时间是1h，酶标二抗的最佳稀释倍数是1：10000，酶标二抗的最佳反应时间是1h。重复性试验，CV＜15％，可重复性好，特异性试验也不与其他血清发生交叉反应。 用已建立的间接ELISA，检测禽流感阳性、试验鸡的阴性、免疫鸡血清，通过测定鸡群总体的OD平均值，鉴别诊断整个鸡群是否感染禽流感病毒，确定间接ELISA的评价指标。经统计学计算，疫苗阴性血清和禽流感阳性血清p＜0.05，差异显著。鸡群阴阳性的临界值按禽流感阴性血清的平均值加三倍标准差(X+3SD)，确定临界值为0.5。当鸡群血清平均OD值大于0.5时，该鸡群已感染禽流感病毒，当鸡群血清平均OD