猪流行性腹泻（Porcine Epidemic Diarrhea;PED）的病原体是猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus;PEDV）,该病具有传播快、流行性广和仔猪致死率高等特点[1]。PED的暴发和流行已给我国乃至全球的养猪业造成毁灭性的打击。目前针对该疾病的主要的防治手段为口服/肌肉注射疫苗、病料反饲等,效果仍然有限。因此,急需开发出新型的病毒防治策略来应对PEDV的感染。近年来,随着分子遗传育种领域的飞速发展,国内外学者均提出,通过培育抗病力强的新猪种（系）,从遗传本质上提高猪群对病毒的抵抗力,是猪病综合防控的有效手段之一。RNAi（RNA interference;RNAi）技术被证实在病毒防治领域具有巨大的潜力和独特的效果,被成功用于多种病毒的预防与治疗。在本研究中,我们首先分析了不同PEDV毒株的基因组,根据PEDV全基因组中的高度保守区域设计并合成了8对si RNA,以PEDV的易感细胞系-小肠上皮细胞系（IPEC-J2）为研究对象,通过电穿孔转染的方式将上述si RNA转染进入IPEC-J2中,进行抗病毒感染研究,攻毒72 h后的结果显示,相比较于对照组和其它si RNA,si RNA-3-2和si RNA-4-2具有更好的抑制PEDV增殖的效果,抑制效率约为20%。我们选择了位于S蛋白基因的si RNA-4-2作为我们的研究对象。然后将新兴的基因编辑技术CRISPR/Cas9技术与RNAi策略相结合,通过极限稀释法筛选出sh RNA-KI阳性克隆,在细胞水平检测了si RNA的表达量,最后对细胞水平的抗毒能力进行了检测,结果证明,该sh RNA-KI阳性克隆可以降低PEDV拷贝数2个数量级,免疫荧光结果也证明了sh RNA-KI阳性克隆可以很好的抑制PEDV在宿主细胞内的增殖。为制备抗PEDV转基因猪奠定了基础。细胞水平的结果为抗PEDV基因编辑猪的成功制备提供了可能性,我们按照sh RNA-KI小肠上皮细胞克隆的方法制备了sh RNA-KI的猪胎儿成纤维细胞阳性克隆,同样是通过极限稀释法筛选阳性克隆,然后利用SCNT以及胚胎移植制备克隆猪。经过114天的妊娠期,仔猪出生后PCR及测序鉴定出sh RNA-KI猪阳性个体,对sh RNA-KI猪进行分离细胞攻毒,结果证明分离出来的体细胞可以降低PEDV的增殖。最后将sh RNA-KI猪扩繁至第三代,si RNA可以稳定遗传表达,通过体外和体内攻毒实验验证了sh RNA-KI转基因猪可以有效的在体内及体外抑制PEDV的增殖。综上所述,我们利用CRISPR/Cas9系统制备了位点特异性的转基因猪细胞和个体。本研究结合CRISPR/Cas9技术,将抑制PEDV增殖的sh RNA整合到猪的p Rosa26位点,验证sh RNA对PEDV感染的影响。其次,利用SCNT技术成功获得了抗PEDV的转基因猪。三代sh RNA-KI猪个体数据检测表明,sh RNA-KI猪的生长和繁殖性能与野生型无差异,体内和体外攻毒实验均表明sh RNA-KI猪能抑制PEDV增殖。在不久的将来,sh RNA递送技术的结合将为大多数冠状病毒提供新的防治思路。