背景和目的甲基乙二醛（methylglyoxal,MG）是糖酵解途径产生的主要副产物[1],在高血糖中血液含量明显增加,导致血管内皮功能障碍和促进血管并发症的发生和发展[2]。蛋白质与葡萄糖发生非酶促反应形成糖苷键的过程被称为糖基化作用。MG是一种高反应性的羰基化合物,其通过与蛋白质或脂类物质发生非酶促糖基化反应生成晚期糖基化终末产物（advanced glycation end products AGEs）,对各种细胞具有毒性作用,导致细胞和组织功能障碍。研究报道,AGEs与阿尔茨海默病[3],帕金森病[4]和糖尿病心脑血管疾病[5,6]的发生和发展有关。MG对血管内皮细胞,神经元细胞,巨噬细胞和胰岛细胞具有毒性作用,导致细胞发生凋亡或死亡。在过去的研究中,越来越多的研究表明MG在血管内皮功能障碍中起着重要作用[2],但是其影响血管内皮功能和对细胞毒性的分子作用机制还不太清楚,因此从分子生物学角度阐明MG对血管内皮细胞的毒性作用机制是至关重要的。利用第二代测序技术进行转录组学的检测是一种高通量筛选目的基因的研究工具,目前已广泛应用于研究各种细胞内信号通路相互作用,探讨疾病致病分子机制等的研究。微小RNA（micro RNA,miRNA）是一类长度约为17-25个核苷酸的内源性非编码单链小分子,通过与靶基因mRNA的3’非翻译区不完全互补配对,参与转录后基因表达调控,对于生物体的生长发育、细胞增殖、凋亡和分化等多种生物学过程具有重要调节作用。最近的研究表明,miRNA在缺血性脑卒中后神经血管损伤、损伤修复[7,8]以及神经退行性疾病[9]的病理生理过程中起重要的调节作用。人脑微血管内皮细胞（human brain microvascular endothelial cell,HBMEC）是构成血脑屏障（blood brain barrier,BBB）最重要的细胞之一,广泛作为一种细胞模型应用于BBB的相关研究。目前,MG和氧糖剥夺/复氧（oxygen glucose deprivation/reperfusion,OGD/R）联合刺激引起HBMEC的miRNA表达变化并不明确。因此,在本研究中,我们以MG和OGD/R联合刺激HBMEC,利用第二代测序技术检测miRNA-mRNA表达谱的改变,对显著差异性表达的miRNA进行实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,q RT-PCR）验证。通过生物信息学分析预测miRNA调控的靶基因,并对靶基因进行基因本体论（Gene ontology,GO）富集和信号通路（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）分析。利用Cytoscape软件绘制miRNA-mRNA调控网络图,筛选可能与MG刺激HBMEC导致细胞毒性调控的miRNA,为进一步研究miRNA在MG和OGD/R联合刺激HBMEC促进缺血性脑卒中BBB破坏中的作用和调控机制以及开发以miRNA为靶点的治疗药物提供研究基础。方法（1）构建氧糖剥夺/复氧下MG诱导HBMEC细胞毒性模型1、分别用四种不同缺氧时间（2h,4h,6h,8h）置于三气培养箱（0.1%O2,5%CO295%N2）中处理HBMEC细胞,对照组HBMEC细胞则置于细胞培养箱（5%CO2,95%空气）中正常培养,利用CCK-8（cell counting kit）试剂盒进行细胞活力检测,根据CCK-8实验结果和参考文献确定合适的缺氧时间。2、分别用六种不同终浓度的MG（8,4,2,1,0.5,0.25m M）处理HBMEC细胞,对照组HBMEC细胞则加入等体积的无菌PBS,CCK-8试剂盒进行细胞活力检测,根据CCK-8实验选择合适的MG刺激浓度。3、实验分组:（1）Control组:HBMEC细胞用DMEME完全培养基（90%高糖DMEM,10%胎牛血清和双抗100U/ml）培养于细胞培养皿中,未进行其它特殊处理。（2）OGD/R组:HBMEC细胞在缺糖缺氧条件下培养4h,缺糖缺氧处理后,替换为正常的DMEM完全培养基,置于含5%CO2,95%空气,37℃正常细胞培养箱中继续培养24h。（3）MG+OGD/R处理组:首先HBMEC用MG处理24h,然后在缺糖缺氧条件下培养4h,缺糖缺氧处理后,替换为正常的DMEM完全培养基,置于含5%CO2,95%空气,37℃正常细胞培养箱中继续培养24h。4、标本收集和检测方法:提取细胞总RNA进行miRNA和mRNA第二代测序检测。（2）第二代测序技术检测miRNA和mRNA表达谱的变化提取各处理组总RNA后用K5500超微量分光光度计分别检测提取纯化后的总RNA在230nm、260nm与280nm波长下的吸光度值,计算吸光度A260/A280比值与吸光度A260/A230比值,检验总RNA的含量以及纯度值。吸光度A260/A280比值在1.8到2.1被认为RNA质量合格,可以用于后续文库制备和测序实验。利用Agilent 2200检测RNA分子完整性指数（RIN,RNA Integrity Number）,RIN≥7被认为RNA质量较好。利用变性琼脂糖凝胶电泳,检验总RNA的完整性。取0.3μg RNA上样于1.5%琼脂糖凝胶,135V电泳25min。常规琼脂糖凝胶电泳时,RNA上样量最好不要超过1μg。采用Illumina Hi Seq TM2500测序平台检测HBMEC细胞的miRNA和mRNA的表达谱。（3）q RT-PCR验证差异性表达的miRNA根据miRNA第二代测序结果,我们挑选了7个显著差异表达的miRNA采用q RT-PCR方法进行验证。（4）miRNA和mRNA生物信息学初步分析对于显著差异表达的miRNA,应用Target Scan、miRDB、miRTar Base、miRWalk四款软件预测miRNA的靶基因,并对靶基因进行GO和KEGG生物通路富集分析,同时利用Cytoscape软件绘制miRNA-mRNA调控网络图。结果（1）糖氧剥夺随时间延长,HBMEC细胞存活率逐渐降低,具有时间依赖性,与对照组细胞相比,存活率差别显著（P＜0.05）,具有统计学意义。（2）MG对HBMEC细胞存活率的影响具有剂量依赖性,浓度越高,细胞存活率越低,与对照组细胞相比,存活率差别显著（P＜0.05）,具有统计学意义。（3）miRNA第二代测序结果:与Control组相比,OGD/R组有47个显著差异表达的miRNA（P＜0.05）,其中25个miRNA在OGD/R处理后的HBMEC细胞表达明显上调,22个miRNA在OGD/R处理后的HBMEC细胞表达明显表达下调。与OGD/R组相比,MG+OGD/R组有22个显著差异表达的miRNA（P＜0.05）,其中12个miRNA在MG+OGD/R处理后的HBMEC细胞表达明显上调,10个miRNA在MG+OGD/R处理后的HBMEC细胞表达明显表达下调。（4）mRNA第二代测序结果:与Control组相比,OGD/R组有564个显著差异表达的mRNA（P＜0.05）,其中317个mRNA在OGD/R处理后的HBMEC细胞表达明显上调,247个mRNA在OGD/R处理后的HBMEC细胞表达明显表达下调。与OGD/R组相比,MG+OGD/R组有251个显著差异表达的miRNA（P＜0.05）,其中97个mRNA在OGD/R处理后的HBMEC细胞表达明显上调,154个mRNA在OGD/R处理后的HBMEC细胞表达明显下调。（5）qRT-PCR验证差异性表达的miRNA:由于第二代测序技术检测基因的表达存在一定的假阳性,因此需要用q RT-PCR验证第二代测序的结果。我们从Control组vs OGD/R组以及OGD/R组vs MG+OGD/R组中共选取7个差异表达的miRNA（miR-451a、miR-148a-3p、miR-199a-5p、miR-410a-5p、miR-4521、miR-4455、miR-6772-3p）进行q RT-PCR实验验证。结果显示,miR-451a、miR-148a-3p、miR-199a-5p、miR-410a-5p、miR-4455、miR-6772-3p验证结果与第二代测序结果一致,miR-4521验证结果与第二代测序结果不一致,因此可以认为第二代测序结果基本能代表miRNA的真实表达水平。（6）生物信息学分析结果显示:在OGD/R组中差异表达的miRNA靶基因参与了包括PI3K-Akt、Hippo、MAPK、Wnt和m TOR等在内的多条信号通路。在MG+OGD/R组中差异表达的miRNA靶基因参与了包括FOXO、AGE-RAGE、PI3K-Akt、TGF-beta和MAPK等在内的多条信号通路。结论（1）MG刺激可引起HBMEC细胞活力明显下降,并且MG刺激可以明显降低氧糖剥夺/复氧下HBMCE细胞的存活率,提示MG对HBMEC细胞的毒性作用。（2）MG和OGD/R联合刺激HBMEC细胞使miRNA表达谱发生明显改变,提示差异表达的miRNA可能介导了氧糖剥夺下MG对HBMEC细胞毒性的分子调控机制,具体机制有待进一步研究证实。第二部分miR-148a-3p在甲基乙二醛促进脑缺血后血脑屏障破坏的功能研究背景和目的缺血性脑卒中具有发病率高和复发率高的特点,占全部脑卒中的60%-80%,是我国人口中致残和致死的主要原因,已成为我国主要的公共健康负担。急性缺血性脑卒中破坏BBB通透性,水和血浆蛋白质进入中枢神经系统增加,导致神经元细胞死亡、血管源性脑水肿和和神经功能障碍。BBB主要由脑微血管内皮细胞及其细胞间紧密连接,毛细血管基底膜及嵌入的周细胞和星形胶质细胞终足形成的胶质膜等组成。研究发现,BBB破坏主要是血管内皮细胞间紧密连接相关蛋白VE-cadherin（Vascular endothelial cadherin）、Occludin、ZO-1（zonula ocludens-1）和Claudin-5等明显降低导致BBB通透性增加[10]。糖尿病是缺血性脑卒中重要的危险因素,长期血糖升高可以导致大脑血管内皮功能障碍和降解血管内皮细胞紧密连接蛋白进而导致BBB破坏[11]。MG是糖酵解过程产生一种高活性ɑ-二羰基醛,在糖尿病中其含量明显增加,是AGEs的重要前体。近来有研究发现,MG可以使脑微血管内皮细胞受损,进而破坏单层微血管内皮细胞屏障的完整性[12],导致糖尿病脑微血管功能障碍[13]。在糖尿病缺血性脑卒中小鼠模型中,抑制MG介导的氧化/羰基应激过程,可以明显改善缺血性脑卒中的预后[14],但是其详细的分子机制还不清楚。因此我们在体内探讨小鼠在MG处理后的脑缺血再灌注损伤模型中梗死区组织miR-148a-3p表达水平的变化及其BBB中的作用。方法（1）动物实验1、健康雄性C57BL/6小鼠按随机数字表法随机分为5组:（1）假手术组（Sham组）;（2）MCAO/R组;（3）MG+MCAO/R组;（4）MG+MCAO/R+agomir control组;（5）MG+MCAO/R+miR-148a-3p agomir组。2、MG腹腔注射:MG持续腹腔注射1个月,每只小鼠称量体重后每天在固定时间点给予腹腔注射MG溶液（50mg/kg）。3、miR-148a-3p激动剂（agomir）侧脑室注射:构建小鼠MCAO/R模型前24h,分别经颅骨孔向左侧脑室注入miR-148a-3p agomir及agomir control稀释液,深度为颅骨表面以下2.1mm,以0.5μl/min速度分别注入5pmol miR-148a-3p agomir或agomir control。Sham组和MCAO/R组以同样方法在相同部位给予等体积的RNase-free H2O。4、参照Yang[15]所报道的大脑中动脉线栓法,并在其实验方法的基础上加以改进构建小鼠MCAO/R模型,Sham组小鼠只分离左侧肌肉,颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉,但不进行MCAO/R线栓梗塞处理。5、采用激光多普勒血流成像系统、神经功能5点评分法、HE病理形态学观察和TTC染色结果鉴定建模是否成功。6、通过q RT-PCR检测miR-148a-3p水平。7、采用神经缺损评分、转角实验、粘贴物移除测试评估动物神经功能缺损情况。8、采用TTC染色方法观察小鼠大脑中动脉缺血再灌注损伤后脑梗死体积。9、BBB渗透性采用伊万斯蓝染色方法测定,脑水肿程度通过测量脑干湿重比评估。10、通过Western blotting的方法观察脑梗死区Bcl-2和Bax凋亡相关蛋白以及VE-cadherin、ZO-1、Occludin、Claudin-5血脑屏障相关蛋白的变化。（2）细胞实验1、转染miR-148a-3p模拟物（mimic）共分为七组:（1）Control组;（2）OGD/R组;（3）OGD/R+mimic control;（4）OGD/R+miR-148a-3p mimic;（5）MG+OGD/R处理组;（6）MG+OGD/R+mimic control;（7）MG+OGD/R+miR-148a-3p mimic。2、转染miR-148a-3p抑制物（inhibitor）共分为七组:（1）Control组;（2）OGD/R组;（3）OGD/R+inhibitor control;（4）OGD/R+miR-148a-3p inhibitor;（5）MG+OGD/R处理组;（6）MG+OGD/R+inhibitor control;（7）MG+OGD/R+miR-148a-3p inhibitor。3、miR-148a-3p mimic和inhibitor的HBMEC细胞转染。4、构建OGD/R下MG诱导HBMEC细胞毒性模型:选择对数生长期的细胞,以1m M终浓度的MG处理细胞,对照组加入等量无菌PBS。MG处理24h后加入不含血清和葡萄糖的DMEM培养基,置于三气培养箱（0.1%O2,5%CO2,95%N2）中分别培养4h,然后替换为正常的DMEM完全培养基,置于含5%CO2,95%空气,37℃正常细胞培养箱中继续培养24h。对照组细胞则常规培养。5、CCK-8实验检测HBMEC细胞活力。6、体外HBMEC单层细胞渗透性检测。结果（1）动物实验1、q RT-PCR结果显示MG+MCAO/R 24h后脑梗死区miR-148a-3p的表达水平与MCAO/R组相比降低,并且侧脑室注射miR-148a-3p agomir后显示脑内含量明显增加,成功上调miR-148a-3p的表达。2、成功构建了小鼠大脑中动脉脑缺血再灌注损伤模型,激光多普勒血流成像检测显示MCAO/R小鼠术中大脑梗死侧脑血流量较术前明显降低,血流ROI百分比值结果显示明显降低。小鼠拔除线栓后脑血流量明显上升,恢复脑血流,实现再灌注。TTC染色结果显示左侧大脑中动脉供血区的梗死区域呈白色,正常脑组织呈红色。神经功能缺损5点评分法显示小鼠表现为对侧上肢不能完全伸展、提起尾巴时向对侧转圈、持续向对侧转圈或是身体向对侧倾和无自发性活动、意识障碍。MCAO/R组小鼠在脑缺血再灌注24h后神经功能评分为1.33±0.70分（n=9）,较Sham组评分显著性升高（P＜0.05）。小鼠大脑中动脉脑缺血再灌注损伤后手术梗死侧HE染色结果显示神经细胞细胞核皱缩,染色加深,边界不清楚,神经细胞胞间出现较多的空泡且体积较大。3、侧脑室注射miR-148a-3p 24h后行MCAO/R,24h后对小鼠进行神经功能缺损评估,和空白组和阴性对照组比较,miR-148a-3p治疗组神经功能经缺损较轻。4、侧脑室注射miR-148a-3p 24h后行MCAO/R,24h后对小鼠进行大脑TTC染色,和空白组和阴性对照组比较,miR-148a-3p治疗组脑缺血再灌注损伤后脑梗死体积均比其余两组小。5、侧脑室注射miR-148a-3p 24h后行MCAO/R,24h后对小鼠进行大脑伊文思蓝染色和脑水含量检测,和空白组和阴性对照组比较,miR-148a-3p治疗组减轻脑缺血再灌注损伤后BBB渗透性和脑水肿。6、侧脑室注射miR-148a-3p治疗后Bcl-2蛋白表达上升。7、侧脑室注射miR-148a-3p治疗后VE-cadherin、ZO-1、Occludin、Claudin-5血脑屏障相关蛋白表达上升。（2）细胞实验1、miR-148a-3p mimic细胞转染能有效增加HBMEC内miR-148a-3p表达水平,miR-148a-3p inhibitor细胞转染能有效降低HBMEC内miR-148a-3p表达水平。2、miR-148a-3p mimic转染促进OGD/R下MG诱导的HBMEC细胞毒性存活率增加,miR-148a-3p inhibitor·转染促进OGD/R下MG诱导的HBMEC细胞毒性存活率降低。3、miR-148a-3p mimic转染降低OGD/R下MG诱导的HBMEC细胞毒性的单层渗透性,miR-148a-3p inhibitor转染促进OGD/R下MG诱导的HBMEC细胞毒性的单层渗透性。结论（1）miR-148a-3p在MG处理的小鼠脑缺血再灌注损伤模型中表达下调。（2）miR-148a-3p agomir对MG促进缺血性脑卒中BBB的破坏具有潜在的治疗作用,减轻BBB的破坏、脑水肿和神经功能缺损。（3）增加miR-148a-3p在脑组织的表达能增加Bcl-2抗凋亡蛋白水平,其可能是保护MG促进缺血性脑卒中BBB的破坏以及改善神经功能缺损的作用机制。