论文部分内容阅读
谷氨酰胺转氨酶（蛋白质-谷氨酸-γ-谷氨酰胺转氨酶，Transglutaminase EC2.3.2.13，TGase），是一种催化酰基转移反应的酶，它以肽链中的谷氨酰胺残基γ-酰胺基作为酰基供体，当酰基受体为多肽中赖氨酸残基的ε-氨基或伯氨基时，它催化蛋白质分子内或分子间的交联、蛋白质、氨基酸、肽链之间的连接；当水为酰基受体时，可催化蛋白质分子内谷氨酰胺基的水解。由于TGase具有提高各种蛋白的功能特性的巨大潜能，主要应用于提高蛋白的质地和稳定性。本文以大肠杆菌Rosetta（DE3）为研究对象，以提高菌体浓度为目标，对重组菌的发酵条件和培养基组分进行了优化研究。在合成培养基的基础上，进行了10L发酵罐小试，并对得到的包涵体蛋白进行溶解、变性、最终得到具有生物活性的谷氨酰胺转氨酶。为了提高重组谷氨酰胺转氨酶的产量，在摇瓶发酵条件下，采用LB培养基对大肠杆菌Rosetta（DE3）的生长及产物表达进行了初步研究，确定了最佳的发酵条件：摇瓶装液量为25mL/250mL，接种量为5%，培养温度为37℃，初始pH7.0，接种4h后（对数中期，OD=0.60.8）进行诱导，诱导剂浓度为0.8mmol/L，诱导持续时间为4h。在上述发酵条件优化的基础上，通过一系列单因子试验及正交实验对培养基成分进行优化，最终确定发酵培养基组成为：葡萄糖4g/L，酵母提取物3g/L，NH4Cl4.0g/L，Na2HPO42.0g/L，KH2PO41.0g/L，MgSO4·7H2O1.0g/L，NaCl3.0g/L，微量元素溶液浓度2.0mL/L，盐酸硫胺素（VB1）1.0mg/L、核黄素（VB2）0.5mg/L、泛酸（VB5）0.5mg/L、盐酸吡哆醇（VB6）0.2mg/L。采用此合成培养基进行摇瓶发酵，最终的OD由1.8提高到5.8左右，重组蛋白的表达量可达36.2%。菌体生长率和菌体浓度都得到大幅度的提高。在以上研究的基础上，采用溶氧反馈流加补料策略，对其进行10L发酵小试，最终OD达到51.5，将发酵液离心，得到湿菌体112g/L，实现了菌体的高密度发酵。表达的目的蛋白主要以包涵体的形式存在，经过初步纯化及复性后，最终得蛋白浓度为4mg/L和比酶活为8.1U/mg蛋白。