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小麦赤霉病是一种世界性的病害,它能造成包括大麦、小麦等禾谷类作物产量上极大的损失。小麦赤霉病主要发生在我国的中部和长江中下游流域,在长江中下游地区病害发生的频率最高且程度最重。随着耕作制度以及气候的变化,小麦赤霉病有大规模严重发生的可能。研究表明,我国小麦赤霉病的流行范围已经开始向山东等北部省份转移,山东省的小麦赤霉病主要优势种群为禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum),它是我国小麦赤霉病的主要病原物。F. graminearum产生的单端孢霉烯族毒素DON以及它的衍生物3-ADON和15-ADON极大的威胁人畜的生命健康并影响籽粒的食用价值,但是对禾谷镰刀菌的产毒机理及致病机制的研究还相对较少。对磷脂酶C的研究发现它在磷脂信号途径中扮演着非常重要的角色,它能催化细胞膜上一系列的合成与降解反应。通过催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(phosphatidylinositol4,5-biphosphate, PIP2)水解产生二酯酰甘油(diacylglycerol, DAG)和三磷酸肌醇(trisphosphate inositol, IP3)。 IP3能够诱导细胞内钙池中的Ca2+释放出来,DAG则能够直接激活钙调蛋白介导激活的Ca2+依赖性蛋白激酶C (Protein kinase C, PKC).磷脂酶C的典型结构包括一个氮端PH结构域、碳端的C2催化区、EF手型结构域和高度保守的X区和Y区。目前已知真菌PLC都属于PLC6型。本实验以禾谷镰刀菌(F. graminearum)菌株01-3做为实验材料,通过NCBI的Blast、Conserved Domain Search Genebank及DNAMAN等生物学网站和软件对禾谷镰刀菌基因组数据库中的PLCs进行了分析；并设计针对禾谷镰刀菌PLC1基因的特异性引物,克隆得到FgPLC1基因；然后构建了FgPLC1基因的敲除载体和回复载体,通过聚乙二醇介导原生质体转化的方法获得了FgPLC1基因敲除突变体和回复突变体；通过对FgPLC1基因敲除突变体和回复突变体表型和毒素含量进行分析,明确了FgPLCl基因在禾谷镰刀菌生长、产孢以及毒素合成等过程中的作用。所得结果如下：1.通过NCBI Blast功能找到了5个禾谷镰刀菌PLC基因,确定了它们在染色体上的位置,各个基因所具有的结构,然后将各个基因分别命名为PLC1、PLC2、PLC3、PLC4、PLC5。根据禾谷镰刀菌PLCl基因序列设计特异性引物,克隆得到禾谷镰刀菌PLC1基因(FgPLC1)。再通过NCBI Conserved Domain Search匕较分析,发现禾谷镰刀菌PLC1的结构与稻瘟病菌PLC1最为相似,都包含PH区,EF手型区、C2结构域、X区和Y区。2.根据禾谷镰刀菌基因组序列设计引物,以质粒pCB1003为基础,以潮霉素抗性基因为遗传标记,通过Overlap技术连接基因敲除同源臂,构建禾谷镰刀菌PLC1基因敲除载体pMDa+b+H。制备了禾谷镰刀菌野生型菌株原生质体,用构建好的敲除质粒聚乙二醇介导转化野生型菌株原生质体,得到禾谷镰刀菌PLC1基因敲除转化子,验证正确后,确定得到禾谷镰刀菌基因敲除突变体△FgPLC1。3.以质粒pCB1532作为基础,构建了FgPLC1基因回复载体,以回复载体质粒转化禾谷镰刀菌基因敲除突变体原生质体,筛选得到禾谷镰刀菌PLC1基因回复转化子,PCR和RT-PCR验证正确后,确定得到禾谷镰刀菌基因回复突变体△FgPLC1-c。4.通过对比野生型菌株和突变体菌株在生长、产孢、基因表达、毒素合成等方面的变化发现,禾谷镰刀菌PLC1基因敲除突变体与野生型相比,气生菌丝数量明显减少,生长速率减慢,菌落颜色变浅；相对于野生型菌株,敲除突变体菌株在氯化钠和刚果红培养基上的生长均受到了抑制,抑制率分别为48.4%、28.2%。在加有过氧化氢的培养基上,敲除突变体菌株受到的抑制率相对于野生型变小,其抑制率为4.4%。与在PDA培养基上的生长相比,在山梨醇培养基上,野生型菌株的生长受到了促进,敲除突变体的生长受到了抑制,抑制率为6.64%；分生孢子产量增大,敲除突变体菌株所产分生孢子的数量约为野生型菌株的两倍；此外敲除突变体分生孢子的长度和宽度均变小,分别比野生型菌株减少了82.5%和35.4%,敲除突变体不能像野生型菌株一样产生正常的有性孢子；敲除突变体Tri5、Tri6基因的表达量也都降低,其中Tri5基因的表达量较野生型下降了78%,Tri6基因的表达量较野生型下降了97%；DON的产量也有所下降,敲除突变体菌株所产DON的含量比野生型菌株减少了76.5%。回复PLC1基因后,这些敲除突变体所产生的变化基本都能能得到恢复。实验结果表明禾谷镰刀菌PLC1基因对禾谷镰刀菌在菌丝生长、孢子形态建成、毒素合成等方面均有重要影响。