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巨噬细胞是一群高度异质性的细胞群体,依赖于不同生理与病理环境条件,可主要极化为经典活化的M1型巨噬细胞和替代活化的M2型巨噬细胞。在肿瘤微环境中,巨噬细胞的极化方式影响肿瘤的转归。尽管极化巨噬细胞调控肿瘤实质细胞生物学行为的研究已经较为深入,但肿瘤实质细胞诱导巨噬细胞极化的作用机制仍有待阐明。本课题使用不同恶性表型的乳腺癌细胞上清液作用于佛波酯处理的THP-1单核细胞株,发现不同恶性表型的乳腺癌细胞上清液均可诱导M0型巨噬细胞极化,且该诱导作用与乳腺癌细胞源性外泌体介导密切相关。以上结果表明,乳腺肿瘤实质细胞可以通过释放的外泌体诱导巨噬细胞M2型极化,这为我们更深入探索肿瘤细胞源性外泌体介导巨噬细胞极化的分子机制提供了良好的基础。目的探索不同恶性表型乳腺肿瘤细胞源性外泌体能否诱导巨噬细胞极化,为靶向外泌体的临床诊疗提供借鉴与参考。方法1、登陆GEO数据库,下载GSE52292原始数据,利用R语言分析软件对现阶段常用的55个巨噬细胞分子标志物的表达进行分析以筛选M0、M1和M2型巨噬细胞分子标志物。使用不同剂量的PMA诱导人单核细胞株THP-1后24h、48h和72h,显微镜下观察细胞形态变化,q RT-PCR与免疫荧光检测M0型巨噬细胞分子标志物CD68的表达。使用100ng/ml的LPS和20ng/ml的IFN-γ诱导M0型巨噬细胞;使用25ng/ml的IL4和25ng/ml的IL13诱导M0型巨噬细胞,q RT-PCR、免疫荧光和流式细胞术分别检测M1型巨噬细胞分子标志物CCR7、TNF-α、IL1β、IL12、HLADR、CXCL10的表达以及M2型巨噬细胞分子标志物CD206、CCL17、CCL18、CCL22和IL10的表达。2、获取高度恶性乳腺癌细胞株BT549、MDA-MB-231（M-231）与低度恶性乳腺癌细胞株MCF7、T47D的细胞培养上清液,与完全培养基按照1:1体积混合后培养M0型巨噬细胞24h、48h和72h,流式细胞术检测M1型巨噬细胞分子标志物CD68/CCR7和M2型巨噬细胞分子标志物CD68/CD206的表达。3、提取高度恶性乳腺癌细胞株BT549、M-231与低度恶性乳腺癌细胞株MCF7、T47D细胞培养上清液中的外泌体,免疫印迹检测CD63的表达;透射电镜、纳米颗粒跟踪分析定性外泌体。将四种肿瘤细胞来源的外泌体添加入完全培养基培养M0型巨噬细胞,流式细胞术检测M2型巨噬细胞分子标志物CD68/CD206的表达。使用10μM的鞘磷脂酶抑制剂GW4869作用于四种乳腺癌细胞株后,将四种肿瘤细胞来源的外泌体添加入完全培养基培养M0型巨噬细胞,流式细胞术检测M2型巨噬细胞分子标志物CD68/CD206的表达。结果1、GSE52293数据集分析结果显示,单核细胞分化为巨噬细胞过程中,CD68表达明显升高;M1处理组中,多数M1型巨噬细胞标志物表达较M0组上升,且与M2组相比有差异;M2处理组中,大多数M2型巨噬细胞标志物表达与M0和M1组相比无明显差异。使用PMA作用于人单核细胞株THP-1后,细胞从悬浮状态的球形细胞转变为簇状贴壁细胞;q RT-PCR与免疫荧光检测显示,20ng/ml的PMA处理THP-1细胞株24h后,M0型巨噬细胞标志物CD68即有稳定的表达。使用LPS联合IFN-γ诱导M0巨噬细胞后,q RT-PCR结果显示,与对照组相比,CCR7、TNF-α和CXCL10的表达在M1型巨噬细胞中表达升高,24h诱导时间点表达明显升高（p<0.05）,且在M1型和M2型巨噬细胞中存在差异;免疫荧光与流式细胞分析显示CCR7阳性细胞数明显增加（p<0.05）。使用IL4联合IL13诱导M0巨噬细胞72h后,q RT-PCR结果显示,与对照组相比,CD206、CCL17、CCL22和IL10的表达在48h和72h诱导时间点表达明显升高（p<0.05）,且在M1型和M2型巨噬细胞中存在差异;免疫荧光与流式细胞分析显示CD206阳性细胞数明显增加（p<0.05）。2、高度恶性表型的乳腺癌细胞株BT549、M-231培养上清液处理M0巨噬细胞后,多数细胞伪足数量增多且变长;低度恶性表型的乳腺癌细胞株MCF7、T47D培养上清液处理M0巨噬细胞后,细胞形态表现为球形且仅少数细胞有伪足。与对照组相比,乳腺癌细胞株培养上清液诱导的巨噬细胞中CCR7表达均无明显变化（p>0.05）,CD206的表达均明显升高（p<0.05）,而不同恶性表型的乳腺癌细胞株上清液诱导的CD206表达无明显差异（p>0.05）。3、免疫印迹检测显示,四种乳腺癌细胞株的培养上清液中提取的外泌体有CD63表达;透射电镜、纳米颗粒跟踪分析显示外泌体呈现杯状、双分子层膜结构且颗粒直径分布在80～200nm之间。乳腺癌细胞株的外泌体添加入完全培养基培养M0型巨噬细胞后,与对照组相比,巨噬细胞的CD206表达均明显上升（p<0.05）,不同恶性表型乳腺癌细胞株组间并无变化（p>0.05）;GW4869作用于乳腺癌细胞后,与对照组相比,由外泌体诱导的巨噬细胞CD206表达均明显下降（p<0.05）,而不同恶性表型的乳腺癌细胞株组间无明显差异（p>0.05）。结论1、M1和M2型巨噬细胞相关分子标志物的表达存在时间差异性;CD68+/CCR7+与CD68+/CD206+的流式细胞术分析可以作为M1和M2型巨噬细胞特异活化的分子标志物检测。2、不同恶性表型的乳腺肿瘤细胞均可以在体外诱导M0巨噬细胞极化为M2型巨噬细胞,该作用可以通过外泌体方式介导。