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本文主要从以下几部分进行论述: 第一部分:rd11小鼠光感受器细胞凋亡进程 目的:观察溶血卵磷脂酰基转移酶1(LPCAT1)缺陷小鼠在视网膜变性过程中细胞凋亡的变化规律。 方法:选用出生5~6只的rd11和野生型C57BL/6J小鼠6窝进行实验,每窝小鼠分别在出生后2、3、4、5及6w随机选取1只小鼠全视野视网膜电图(full-fieldelectroretinography,F-ERG)检测结束后取材,左眼用于冰冻切片,右眼用于石蜡切片。用TUNEL检测不同年龄段视网膜的细胞凋亡进程,并用激光扫描共聚焦显微镜观察。苏木精伊红染色检测小鼠光感受器细胞的结构并在光学显微镜下观察。实验中选择同龄的C57BL/6J小鼠作为对照。 结果:F-ERG检测发现rd11小鼠与对照组C57BL/6J小鼠相比暗适应最大反应各年龄组均降低,有统计学差异。光学显微镜下观察发现rd11小鼠视网膜光感受器细胞层随年龄逐渐减少,对照组光感受器细胞结构基本正常。激光扫描共聚焦显微镜下观察发现,rd11小鼠2w龄时视网膜内核层(INL)、外核层(ONL)出现少量的凋亡细胞,3w龄时可见INL、ONL凋亡细胞开始增多,4w龄时INL、ONL凋亡细胞达到最多,5w龄时视网膜凋亡细胞开始出现减少的趋势,6w龄时细胞凋亡更加减少,凋亡细胞零星可见。外周部细胞凋亡于3w之前较中央部多,3w之后基本一致。各年龄段的细胞凋亡均以ONL最为显著,神经节细胞(GCL)层变化不明显。C57BL/6J小鼠2w龄时少量凋亡细胞可见,3 w~6w龄时无凋亡细胞出现。 结论:Lpcat1基因突变致rd11小鼠视网膜光感受器细胞出现细胞凋亡,视锥视杆细胞功能下降及影响视网膜细胞结构。 第二部分:小鼠经角膜途径行视网膜下腔注射的方法学研究 目的:介绍一种小鼠视网膜下腔注射的有效方法,使用光学相干断层扫描(optical coherence tomography,OCT)动态成像系统、视网膜电生理检查和形态学观察评估注射导致的网脱和损害。 方法:2月龄C57BL/6J小鼠经充分散瞳后全身麻醉,在眼科专用手术显微镜直视下,在角巩膜缘内侧瞳孔范围内用301/2 gauge的一次性尖针头穿刺角膜做隧道切口,避免伤及虹膜和晶状体,然后用带33 gauge平针头的微量进样器沿穿刺口进入,针头绕过晶体后到达玻璃体,然后直视下逐渐进针至神经视网膜层和视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)层之间的潜在视网膜腔隙并缓慢推注。注射后的眼球分四组做分析:第一组,80%~100%转染组;第二组,50%~70%转染组;第三组,角膜穿刺后模拟视网膜下腔注射过程,不注射生理盐水荧光素钠;第四组,眼球无任何处置。注射后活体小鼠3天内视网膜脱离的复位情况通过OCT随访,视网膜功能和显微结构分别通过全视野视网膜电图(full-fieldelectroretinography,F-ERG)和石蜡切片于术后5周光镜观察。 结果:经过一段时间训练后,注射后致视网膜神经上皮层和RPE层分离面积超50%的几率基本能达70%以上。视网膜重新复位多发生在注射后1、2d。注射后5w,与对照组组相比,80%~100%转染组F-ERG暗室混合最大反应b波振幅平均下降22%,50%~70%转染组平均下降16%,假注射组平均下降7%。对照组与假注射组相比无统计学意义,与50%~70%转染组和80%~100%转染组有统计学意义。组织病理学分析显示除注射部位光感受器细胞出现损害外,其它区域保持完整。 结论:经角膜视网膜下腔注射是一种有效和实用的方法,应用此方法能最低限度降低因注射所致网脱引起的形态和功能学的损害。