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多药耐药(multidrug resistance,MDR)的出现已然成为临床治疗白血病的一大难题,对于其耐药机制的研究,目前葡萄糖神经酰胺合成酶(glucosylceramide synthase,GCS)在肿瘤耐药中的作用越来越受到人们的关注。已知GCS是鞘脂代谢中的糖基化酶,其最直接的功能是将尿核苷二磷酸葡萄糖(UDP-glucose)上的糖基转移至神经酰胺(Ceramide,Cer)形成葡萄糖神经酰胺(Glycosylceramide,Glc Cer),为高级鞘糖脂的合成提供合成前体,同时降低了细胞内的Cer水平。作为信号转导的脂质第二信使,Cer广泛参与细胞生长、分化、衰老及死亡等生理过程。Cer水平降低使细胞分化、凋亡等功能抑制,自然而然也成为GCS诱导肿瘤耐药的原因之一。以往关于GCS诱导肿瘤耐药的研究多集中在GCS对细胞膜上药物转运排出泵的影响。多药耐药基因1(multidrug resistance gene 1,MDR1)编码的P170糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)是研究最多的肿瘤耐药分子。当药物进入细胞,P-gp与药物分子结合并在ATP的驱动下将药物转移至细胞外,使细胞内药物始终维持在较低水平。研究发现,不同系统肿瘤中GCS可通过上调P-gp促进抗肿瘤药物的泵出,进而导致细胞耐药的产生。然而亦有研究报道称,即便抗癌药物突破细胞外排这一屏障到达其作用的靶点,由于细胞凋亡通路受抑,这些抗癌药物仍旧无法消灭肿瘤细胞,说明凋亡通路异常也是肿瘤耐药的重要原因之一。Bcl-2是癌细胞特有的一类基因家族,主要在线粒体膜上发挥对细胞凋亡的调控作用。根据Bcl-2家族各分子的结构以及发挥的生物学效应不同可将Bcl-2家族分为:(1)以Bid为代表的只具有BH3结构域、能对刺激产生反应并被激活的BH3蛋白;(2)以Bax为代表的能使线粒体外膜通透性增加进而激活凋亡级联反应的凋亡执行蛋白;(3)以Bcl-2为代表的抑制BH3和凋亡执行蛋白的抑凋亡蛋白。Bcl-2主要通过阻止线粒体细胞色素C的释放从而抑制细胞凋亡。大量数据显示Bcl-2蛋白增加或Bax蛋白减少是多种肿瘤细胞对化疗不敏感的重要原因。上调Bax或下调Bcl-2的基因水平可使细胞对肿瘤药物的敏感性增强。本课题组前期研究发现,与K562敏感细胞株比较,K562/A02白血病多药耐药细胞株中GCS与Bcl-2的表达明显增高,而Bax的表达无明显差异;下调GCS,Bcl-2的表达水平亦明显下降,而Bax的表达不受影响;此外课题组发现K562/A02的耐药性还与ERK信号通路有关,该通路介导了GCS对P-gp转运蛋白的调控。由于ERK信号通路与细胞凋亡密切相关,ERK介导的信号转导可能是多种信号刺激的共同通路。研究发现ERK通路的激活亦是线粒体去极化、细胞色素C释放、caspase3活化以及细胞凋亡的必要前提。因此,本文就GCS上调Bcl-2表达从而诱导白血病耐药的分子机制进行研究,探讨ERK信号通路是否参与GCS对凋亡的抑制过程,以期揭示GCS诱导白血病的耐药新机制,为逆转肿瘤耐药提供新的思路。目的:探讨人白血病多药耐药细胞株K562/A02中GCS对凋亡相关基因Bcl-2表达水平的影响,明确GCS在白血病耐药中的作用机制。方法:利用RNA干扰技术靶向抑制K562/A02细胞中的GCS后,real-time PCR和western blotting检测Bcl-2 m RNA与蛋白、MAPK成员蛋白表达的变化情况;流式细胞术检测细胞凋亡;CCK-8法检测细胞对阿霉素(Adriamycin,ADM)的敏感性以及高效液相色谱—质谱联用分析细胞中的Cer水平。20μM U0126处理K562/A02细胞24 h后,CCK-8法检测细胞对ADM的敏感性;流式细胞术观察U0126和ADM单独或联合使用时细胞凋亡水平的变化;real-time PCR和western blotting分别检测U0126以及Cer对细胞Bcl-2 m RNA与蛋白、ERK信号通路活化的影响。结果:GCS si RNA下调K562/A02细胞中GCS表达后,细胞对ADM的凋亡增加、药物敏感性增强,Bcl-2 m RNA与蛋白水平下降,Cer含量增加;western blotting结果显示p-ERK表达减少,但总ERK、总的以及磷酸化JNK和p38 MAPK的表达无明显变化。MEK特异性抑制剂U0126作用K562/A02后,细胞对ADM凋亡增加、药物敏感性增强,Bcl-2 m RNA与蛋白以及p-ERK水平呈浓度依赖性和时间依赖性下降;外源C6-神经酰胺(C6-Ceramide,C6-Cer)也可显著抑制K562/A02细胞中ERK的磷酸化激活和Bcl-2抑凋亡蛋白的表达。结论:ERK信号通路介导GCS上调抑凋亡蛋白Bcl-2的表达从而抑制K562/A02细胞对ADM的敏感性,诱导白血病细胞多药耐药。Cer作为GCS的酶催化底物,在GCS高表达时水平下降是激活ERK通路的上游信号。