膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，其发病率呈逐年上升趋势，具有多发性和易复发等特点，70％-80％为浅表性膀胱癌。据文献报道，经尿道膀胱肿瘤电切术(TURBt)或膀胱部分切除术后2年肿瘤复发率达50％-70％，而且复发的病例中有10％-30％伴有恶性程度增高或浸润能力增强。因此，术后行膀胱灌注药物治疗对于预防肿瘤复发具有重要意义。 目前常用膀胱癌腔内治疗的药物有两类，一类是化疗药物，如丝裂霉素、阿霉素、噻替哌等；另一类是免疫增强剂，如BCG、白介素-2(IL-2)、γ-干扰素(INF-γ)等。化疗药物的副作用较少，但常引起膀胱癌细胞多药耐药基因的激活，高表达P-gp糖蛋白，将抗癌药物泵出细胞外，使化疗药物药效降低，达不到治疗目的，术后复发率高，例如5年复发率噻替哌44％-51％，阿霉素33％-42％，丝裂霉素42％-49％。BCG是应用最早的肿瘤治疗生物制剂，在预防膀胱癌术后复发，防止肿瘤进展作用上有显著疗效，治疗浅表性膀胱癌术后五年复发率仅为18.9％。此外BCG还有治疗作用，对残留小肿瘤有效率为50％-60％，对原位癌的完全有效率为70％-75％，引起5年以上持久缓解的总有效率平均为70％。把BCG直接灌入上部集合系统，可有效治疗上泌尿道移行细胞癌。 本实验通过对BCG进行分离和纯化，得到抗肿瘤及免疫调节的有效成分和Ag85B，并对BCG、BCG有效成分和Ag85B的免疫调节活性及抗小鼠膀胱的治疗作用进行分析，旨在寻求治疗膀胱癌的更佳药物，这对膀胱癌的治疗有重要意义。本实验分三部分进行。 第一部分BCG对小鼠体外脾淋巴细胞增殖及细胞因子产生作用的研究 目的：通过BCG对小鼠脾淋巴细胞的增殖作用以及诱导小鼠脾淋巴细胞产生细胞因子的作用来探讨BCG的免疫调节活性。 方法：1.采用MTT法测定不同浓度的BCG对小鼠脾淋巴细胞的增殖作用。2.采用ELISA方法检测经过不同浓度BCG作用后诱导小鼠脾淋巴细胞分泌IL-2、TNF-α、INF-γ等细胞因子的含量。 结果：体外增殖实验表明：在体外培养的小鼠脾淋巴细胞中加入浓度为3.6×103cfu/ml以下的BCG时，对小鼠脾淋巴细胞的促增殖作用不明显，其PI值为1.02。而加入浓度为3.6×103cfu/ml的BCG时，则可以明显促进小鼠脾淋巴细胞的增殖(P＜0.01)，而且，这种促进作用随着BCG浓度的增加而显著增强。在BCG浓度为3.6×106cfu/ml时促增殖作用最强，PI值达到6.82。 结论：1.BCG对于小鼠脾淋巴细胞的增殖具有促进作用，这种作用具有一定的剂量效应关系。2.BCG能够刺激小鼠脾淋巴细胞分泌多种细胞因子，如IL-2、TNF-α和INF-γ等。这种作用也同样具有一定的剂量效应关系。 第二部分BCG有效成分及Ag85B免疫调节机制的实验研究 目的：提取、分离、纯化并且鉴定BCG的有效成分及Ag85B，分析BCG不同成分及Ag85B对小鼠脾淋巴细胞的增殖作用及诱导小鼠脾淋巴细胞产生细胞因子的作用，探讨其有效组分及Ag85B的免疫调节活性。 方法：采用酶裂解法和超声波破碎法对BCG进行裂解，提取其活性蛋白成分。2.采用紫外吸收比色法测定提取蛋白的纯度；应用考马斯亮兰G250方法测定提取物的蛋白含量。3.采用葡聚糖凝胶层析方法对BCG提取物进行组分分离。采用SDS-PAGE凝胶电泳方法对层析后的BCG提取物进行纯度及分子量的鉴定。4.将构建的pGESAg85B/BL21活化后接种于LB培养基中，异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白的表达，包涵体变性后经梯度浓度尿素复性,GSTSepharose亲和层析、凝血酶切除GST并再次亲和层析纯化得到纯化的Ag85B蛋白。5.采用MTT法测定BCG有效提取成分及Ag85B对小鼠脾淋巴细胞的增殖作用，同时采用ELISA方法检测经过BCG有效提取成分及Ag85B诱导作用后小鼠脾淋巴细胞分泌IL-2、TNF-α、INF-γ等细胞因子的含量。 结果：1裂解BCG提取其活性蛋白成分。经过紫外吸收比色方法测定BC裂解成分的蛋白纯度A280nm/A260nm为1.71；采用考马斯亮兰G250方法测定提取物总蛋白含量为9.8mg/ml。 第三部分BCG、BCGE2及Ag85B对小鼠膀胱癌的治疗及机制的研究 目的：膀胱移行细胞癌是泌尿系统最常见的肿瘤，其复发率高一直是困扰临床医生的严重问题，因此，寻找一种有效的药物来控制肿瘤生长，降低复发率对膀胱癌的治疗至关重要。BCG被认为是目前治疗膀胱癌的最有效的药物，但存在许多不良反应。Ag85B是BCG的重要成分之一，是分枝杆菌最主要的分泌蛋白，能够诱导机体强烈的Th1免疫反应，并在分枝杆菌细胞壁合成中发挥重要作用，还具有与纤维粘连素相结合的特性。该蛋白能够诱导Th1型免疫细胞分泌IL-2、TNF-α和INF-γ等细胞因子。本实验通过检测BCG及其相关成分对免疫细胞产生各种细胞因子的作用，观察抑瘤率和荷瘤小鼠生存期，分析肿瘤细胞坏死和凋亡情况，对BCG、BCGE2及Ag85B对小鼠膀胱移行细胞癌作用效果及机制作初步探讨，旨在为寻求对膀胱癌治疗的更佳药物提供一定的依据。 材料与方法： 1小鼠可移植性膀胱细胞癌动物模型的建立。 1.1BTT739膀胱移行细胞癌株由上海市第一人民医院病理科提供，常规培养传代分瓶，培养至对数生长期。T739小鼠由中国医学科学院肿瘤研究所提供，由河北医科大学实验动物中心饲养。 1.2T739近交系小鼠4～6周龄共48只，体重18～22克，随机平均分为四大组，雌雄各半。每大组平均分为两小组，雌雄各半。每只小鼠右侧腋下皮下注射浓度为5.0×106/ml的BTT7390.1ml。 2药物干预膀胱移行细胞癌的生长。各组小鼠分别于接种膀胱癌细胞的第1天、第5天、第9天、第13天、第17天、分别在肿瘤结节周围注射生理盐水、BCG、BCGE2及Ag85B。生理盐水组作为对照组，其他组作为治疗组。第18天每大组随机处死1小组，处死组取血离心分离血清并解剖瘤组织称重，根据瘤重计算抑瘤率：抑瘤率(％)=(1-治疗组平均瘤重/生理盐水组平均瘤重)×100％。瘤组织分3部分，分别行病理检查、电镜和流式细胞分析。另1小组观察荷瘤鼠观察生存期，并计算存活延长率。存活延长率(％)=(治疗组平均存活天数/生理盐水组平均存活天数-1)×100％。 结果： 1.1处死小鼠解剖瘤组织称重，生理盐水组、BCG组、BCGE2组及Ag85B组T739瘤小鼠的平均瘤重分别为(6.67±1.54)g、(4.24±1.19)g、(3.90±1.58)g、(2.80±1.05)g。后三组平均抑瘤率分别为36.43％、41.52％、58.02％。生理盐水组荷瘤小鼠平均瘤重明显高于其余三组，差别有显著性(P＜0.05)；Ag85B处理组荷瘤小鼠平均瘤重明显低于其它两组，其差别有显著性(P＜0.05)。其余两组之间无差别。 1.2生理盐水、BCG、BCGE2、及Ag85B处理后各组小鼠的平均生存期分别为18.58±1.83天、24.42±5.51天、25.12±4.64天、30.25±5.43天。生理盐水组荷瘤小鼠平均生存期明显低于其余三组，差别有显著性(P＜0.05)；其余三组中Ag85B组明显长于其余两组，差别有显著性(P＜0.05)，余两组之间无差别。各治疗组荷瘤小鼠存活延长率依次为31.43％、35.20％、62.81％。 2.1ELISA法检测各组小鼠血清的IL-2浓度。生理盐水组IL-2浓度明显低于其他三组，差别有显著性(P＜0.05)，Ag85B组IL-2明显高于其他三组，差别有显著性(P＜0.05)，BCG组、BCGE2组之间无统计学差别。 2.2各组小鼠血清TNF-α和IFN-γ含量。生理盐水组明显低于其余三组，差别有显著性(P＜0.05)，其余三组中Ag85B组TNF-α和IFN-γ含量明显高于其它两组，差别有显著性(P＜0.05)，BCG组、BCGE2组之间统计学上无差别。 结论：1BCG、BCGE2及Ag85B均能够明显抑制肿瘤生长，延长荷瘤鼠生存期，其中Ag85B的效果最好。 2BCG、BCGE2及Ag85B均能使荷瘤鼠血清IL-2、TNF-α、IFN-γ浓度升高。其中Ag85B对小鼠细胞因子的诱导水平要高于其他两种物质，这可能由于该物质经高度纯化去除了其他物质的干扰。IL-2、TNF-α、IFN-γ等细胞因子浓度的提高可能是该三种物质治疗膀胱癌的重要环节之一。