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聚苹果酸(Poly (β-malic acid), PMA)是以苹果酸为唯一单体通过酯键连接而成的高分子聚合物。聚苹果酸具有高度水溶性、生物相容性、生物可降解性、生物可吸收性、无免疫原性及可化学修饰性等特性。目前,聚苹果酸正被开发用于药物载体、微胶囊材料、生物医学材料、化妆品、食品包装材料及表面活性剂等方面。聚苹果酸的合成主要有化学合成法和生物发酵法两种。化学法生产聚苹果酸有很多弊端,例如反应条件苛刻、产品的分子量较低及产物分离纯化难度大等问题,而生物发酵法合成的聚苹果酸产物较纯,分子量大,反应条件温和,近年来人们更加倾向于生物发酵法合成聚苹果酸的研究。本文针对目前发酵法生产聚苹果酸整体发酵水平偏低、无法满足工业化生产的需求等方面的不足,利用本实验室筛选保藏的出芽短梗霉(Aureobasidum pullulan FMT1801)菌株,开展生物质资源甘薯、玉米芯水解液等为底物发酵生产聚苹果酸的研究,主要内容如下：1.以鲜甘薯为原料,采用酸水解和双酶水解法制备甘薯水解液,考察了初始水解液糖浓度、氮源、初始pH、代谢中间物对出芽短梗霉发酵甘薯水解液生产聚苹果酸的影响。结果表明以初始水解液浓度120g/L、酵母粉3g/L、柠檬酸7.5g/L、初始pH6.0为条件,摇瓶发酵96小时,PMA产量达到16.59g/L,产率0.14g/L.h,得率为0.20g/g。7L发酵罐分别进行分批发酵和补料发酵,分批发酵72h,PMA产量最高达29.55g/L产率0.25g/L.h,得率为0.28g/g；补料发酵168h,PMA产量达51.37g/L,产率0.31g/L.h、得率0.20g/g。进一步通过纤维床固定化生物反应器,实现出芽短梗霉的固定化高密度培养,补料发酵168h,PMA产量至58.93g/L,产率0.35g/L.h,得率0.18g/g。采用纤维床固定化技术,PMA产量比游离细胞提高了12.8%。研究结果表明,甘薯是一种可利用的廉价生物质资源,可用于出芽短梗霉发酵生产PMA。2.通过不同的酸中和剂(CaCO3、Na2CO3、NaOH)考察对聚苹果酸发酵过程的影响,3L发酵罐发酵结果显示,以Na2C03溶液控制pH效果最佳,发酵96小时,PMA产量达到38.13g/L,产率0.53g/L.h,得率0.61g/g,相比NaOH控制发酵过程pH,PMA产量提高了38%。细胞生理代谢参数分析发现,发酵24小时后,呼吸熵(RQ)、二氧化碳释放率(CER)持续下降,表明CO2固定途径可能在PMA的合成过程中起一定作用；进一步在摇瓶水平考察CO2固定途径中关键酶丙酮酸羧化酶的辅因子生物素对聚苹果酸发酵过程的影响,结果表明添加生物素70mg/L有利于PMA的积累,与对照组相比,PMA产量提高了37%。上述结果初步表明CO2固定途径可能成为PMA生物合成的关键调控点。3.为提高出芽短梗霉对玉米芯水解液中糠醛、5-羟甲基糠醛等毒性物质的细胞耐受性,以玉米芯水解液为底物,在纤维床固定化生物反应器进行连续批培养,通过三个水解液浓度梯度(110～130～150g/L),对出芽短梗霉进行连续适应性驯化,结果表明,出芽短梗霉连续批培养过程,水解糖消耗速率明显加快,PMA得率从初始0.28g/g提高到0.3g/g。进一步平板分离筛选,发现驯化后的突变株对玉米芯水解液的耐受性相比出发菌明显提高,研究表明采用固定化连续批培养技术可以实现出芽短梗霉的适应性进化,提高细胞的耐受性。