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提高母猪繁殖性能是现代化养猪生产的一个重要环节。妊娠后期母猪糖代谢异常会影响母猪繁殖性能和新生仔猪健康。而妊娠后期母猪肝脏极易遭受妊娠应激的重创,出现肝脏糖代谢紊乱。丙酮酸是肝脏糖代谢途径中的关键中间代谢产物,在三大营养物质的代谢周转中发挥重要作用,关系母体健康。因此,控制肝脏丙酮酸代谢平衡可能是缓解妊娠后期母猪糖代谢异常的关键措施之一。肝脏是体内糖脂营养物质代谢的主要场所,也是遭受乙酰化修饰的靶器官。肝脏糖代谢途径上的关键酶与转录因子会受到乙酰转移酶P300/CBP结合因子(P300/CBP associated factor,PCAF)的调控,诱导肝脏糖代谢发生紊乱,降低能量利用效率。山竹醇,作为PCAF的天然抑制剂,是一种安全、可靠的绿色植物提取物,广泛应用在啮齿动物的日粮补充剂中,但目前还未有在妊娠后期母体日粮添加山竹醇探究对母体肝脏丙酮酸代谢影响的研究。因此,我们可提出科学问题,妊娠后期山竹醇是否通过抑制PCAF调控母体肝脏丙酮酸代谢进而缓解机体糖代谢异常,其调控的分子机制是什么,这些问题值得我们深入研究。本研究首先以妊娠后期母猪为研究对象,探讨妊娠母猪肝脏糖代谢的乙酰化规律和PCAF的表达情况;随后在肝细胞和妊娠大鼠肝脏中,验证乙酰化修饰调控肝脏丙酮酸堆积的分子机制;最后,通过给妊娠母猪群体饲喂不同浓度山竹醇,揭示山竹醇对妊娠母猪机体糖代谢的调控机制及营养干预措施。第一部分妊娠后期母猪肝脏糖代谢特点及乙酰化规律研究本实验以6头妊娠100 d母猪和6头未妊娠母猪为研究对象,取肝脏样品,首先利用代谢组学技术分析妊娠后期母猪肝脏的糖代谢特点,接着利用乙酰化蛋白组学技术研究妊娠后期母猪肝脏糖代谢的乙酰化规律,并进一步分析妊娠后期母猪肝脏中的乙酰化酶表达。主要结果如下:1.通过代谢组学分析妊娠组和未妊娠组母猪肝脏代谢产物,妊娠母猪肝脏中糖酵解/糖异生通路中葡萄糖含量下降(P<0.05),磷酸烯醇式丙酮酸、丙酮酸、乳酸含量显著升高(P<0.05);TCA循环的中间代谢产物含量显著下降(P<0.05)。妊娠后期母猪肝脏中糖代谢关键酶的活性与m RNA表达:糖酵解限速酶丙酮酸激酶(PK)活性显著升高(P<0.05),而m RNA表达无明显变化(P>0.05);糖异生关键酶丙酮酸羧化酶(PC)和磷酸烯醇式丙酮酸激酶(PEPCK)的活性无显著变化,但是其m RNA表达都显著降低(P<0.05);谷丙转氨酶(ALT)与丙酮酸脱氢酶(PDH)的酶活和m RNA表达均无显著变化(P>0.05);乳酸脱氢酶B的酶活显著下降(P<0.05),m RNA表达无明显变化(P>0.05)。2.妊娠后期母猪肝脏中基于糖代谢的乙酰化蛋白组分析结果显示:发生乙酰化的糖代谢相关蛋白共鉴定到12个。其中,糖代谢相关的2个转录蛋白(PGC-1α、Fox O1)和6个糖代谢关键酶(GAPDH、PGK、PFK、LDH、MDH、PDH)的乙酰化状态均显著上调,而4个糖代谢转运蛋白(UGP2、RGN、RGT2、SNF3)的乙酰化水平均呈现下调状态,结果与KEGG通路分析相符合。相比于未妊娠母猪肝脏,妊娠组肝脏中PCAF的表达量发生了显著升高(P<0.05),P300与GCN5的表达没有显著变化(P>0.05)。说明PCAF在妊娠后期母猪肝脏中的过量表达可能是引起糖代谢紊乱的关键蛋白。以上结果表明,妊娠后期母猪肝脏中糖酵解增强,糖异生能力减弱,丙酮酸代谢乳酸生成增多;丙酮酸的代谢命运的改变导致肝脏糖代谢发生紊乱。同时妊娠后期母猪肝脏中糖代谢相关蛋白发生高度乙酰化,乙酰转移酶PCAF表达量显著升高。第二部分乙酰转移酶PCAF调控猪肝细胞丙酮酸代谢的分子机制本研究分离培养猪肝细胞利用Co-IP、Western blot、RNA干涉及基因过表达等实验技术验证了PCAF和丙酮酸代谢相关代谢酶的修饰及调控关系,主要结果如下:1.PCAF对猪肝细胞糖异生/糖酵解的结果显示:过表达PCAF后,肝细胞中葡萄糖含量显著下降(P<0.05),丙酮酸与乳酸含量显著升高(P<0.05);过表达PCAF显著提高PGC-1α、Fox O1乙酰化水平,导致了其活性的下降进而抑制下游目的蛋白G6P和PEPCK的表达(P<0.05)。过表达PCAF显著提高PFK、GAPDH、PGK、LDHB的乙酰化水平(P<0.01),敲除PCAF后能够逆转这种效果;PCAF过表达组中葡萄糖13C标记的丰度下降了60-70%,乳酸13C标记的丰度升高了50-60%;表明PCAF乙酰化会加剧糖酵解,减弱糖异生。2.山竹醇对肝细胞丙酮酸代谢的结果显示:肝细胞中添加山竹醇后,可以显著的抑制PCAF的活性和表达(P<0.05);显著提高葡萄糖含量,同时降低丙酮酸和乳酸的含量(P<0.05)。同时,糖异生转录因子PGC-1α和Fox O1以及乳酸清除关键酶LDHB的活性显著升高,糖酵解途径的关键酶PFK、GADPH、PFK活性显著降低(P<0.05)。添加山竹醇提高葡萄糖13C标记的丰度,降低乳酸13C标记的丰度和丙酮酸/葡萄糖比率(P<0.05)。肝细胞中添加山竹醇后,显著提高了DNA的含量及线粒体复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的活性(P<0.05)。以上结果表明,PCAF乙酰化糖异生关键转录因子PGC-1α和Fox O1使得G6P和PEPCK表达下降,糖异生能力减弱;乙酰化糖酵解关键酶PFK、GAPDH和PGK,加剧糖酵解,丙酮酸和乳酸生成增多,同时乙酰化LDHB抑制了乳酸清除。第三部分山竹醇缓解妊娠后期母鼠肝脏丙酮酸堆积的作用机制本研究将48只孕鼠随机分为对照组和添加100mg/kg山竹醇(低剂量组)、300mg/kg山竹醇(中剂量组)、500mg/kg山竹醇(高剂量组),每组各12只。分析检测了肝脏及血液指标。主要结果如下:1.山竹醇对妊娠大鼠肝脏糖代谢的结果显示:与对照组和低剂量组相比,中、高浓度山竹醇组显著提高了血液中葡萄糖含量(P<0.05),显著降低血液中乳酸、丙酮酸的含量(P<0.05);三个浓度山竹醇组均可以显著提高妊娠大鼠的抗氧化功能(P<0.05);随着妊娠周期增加,PCAF活性逐渐升高,在妊娠后期PCAF的活性达到最高(P<0.05)。添加中、高浓度山竹醇能够显著抑制PCAF活性(P<0.05)。2.山竹醇对妊娠大鼠肝脏糖异生/糖酵解的结果显示:与对照组相比,中、高浓度山竹醇可以降低糖异生关键转录因子PGC-1α、Fox O1的乙酰化水平,增加其转录活性进而提高下游目的蛋白G6P和PEPCK的表达(P<0.05)。糖酵解关键酶PFK、GAPDH、PGK的乙酰化水平在三个浓度的山竹醇组中都被显著抑制(P<0.05),并且高浓度组的效果最好;中、高浓度山竹醇组的LDHB乙酰化水平与对照组相比也显著下降(P<0.05)。以上结果表明,山竹醇可以缓解妊娠后期大鼠肝脏的丙酮酸和乳酸堆积,其机制通过抑制PCAF乙酰转移酶活性。第四部分山竹醇改善妊娠后期母猪机体糖代谢的作用效果研究本试验通过选择健康经产的母猪(长大二元杂)60头,按照胎次相近的原则,将母猪分为对照组(基础日粮)与3个浓度山竹醇组(分别添加100、300、500 mg/kg山竹醇),每组各15头,试验预饲期7天,试验期从妊娠期60d开始,直到分娩结束。实验结束后测定母猪及仔猪性能、母猪血液糖代谢产物及抗氧化功能等指标。主要结果如下:中、高浓度山竹醇组显著提高了新生仔猪的出生窝重(P<0.05);3个浓度的竹醇组相对于对照组均显著降低了仔猪的死亡率(P<0.05);山竹醇可以提高妊娠母猪机体的抗氧化能力(P<0.05);山竹醇(低、中、高)显著提高妊娠第90d和110d母猪血液中葡萄糖含量,降低丙酮酸、乳酸含量(P<0.05)。三个浓度的山竹醇组均显著降低了母猪脐带动静脉血中的丙酮酸的浓度(P<0.05)。另外,中、高浓度山竹醇组也都显著降低了母猪脐带动静脉血中的乳酸浓度(P<0.05);与对照相比,日粮添加中、高浓度的山竹醇课显著提高新生仔猪血液中葡萄糖的含量,降低丙酮酸含量(P<0.05),3个浓度的山竹醇组均显著降新生仔猪血液中乳酸的含量(P<0.05)。以上结果表明,妊娠后期日粮添加山竹醇可提高母猪的抗氧化能力和糖代谢稳态,减少母猪的第二产程,降低脐带血中乳酸含量,从而降低新生的仔猪死亡率,并提高新生仔猪的糖代谢稳态。综上所述,本研究的主要结论如下:(1)妊娠后期母猪肝脏会发生糖代谢紊乱,葡萄糖含量下降,丙酮酸与乳酸发生堆积。妊娠后期母猪肝脏糖代谢相关蛋白发生高度乙酰化,并伴随着PCAF的异常表达。(2)PCAF乙酰化修饰糖异生转录因子(PGC-1α、Fox O1)、糖酵解关键酶PFK、GAPDH、PGK、LDHB,改变其活性,加快糖酵解进程,抑制糖异生和乳酸清除能力。(3)山竹醇可抑制PCAF活性,减弱PCAF对糖代谢相关蛋白的乙酰化,增加妊娠大鼠肝脏葡萄糖含量,缓解丙酮酸和乳酸在肝脏的堆积,提高肝脏抗氧化能力和线粒体功能。(4)日粮添加山竹醇能够改善妊娠后期母猪机体的糖代谢,提高繁殖性能与抗氧化能力,缩短母猪产程时间,提高新生仔猪血液葡萄糖含量。