褐飞虱对噻虫胺代谢抗性及其调控机制

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褐飞虱Nilaparvata lugens(St(?)l)是亚洲国家水稻生产中极具破坏力的害虫之一,可造成严重经济损失。目前我国褐飞虱的防治仍主要依赖化学杀虫剂,但由于杀虫剂大量使用所导致的褐飞虱抗药性问题日益突出,已对多种类别杀虫剂产生不同水平抗性。包括噻虫胺在内的新烟碱类杀虫剂被广泛用于稻田褐飞虱防治,但田间褐飞虱已对噻虫胺产生抗性且抗性水平呈逐年上升趋势。因此,明确褐飞虱对噻虫胺的抗性进化机制,对制订高质量害虫抗性治理策略、延长该药剂田间使用寿命,确保水稻安全生产等有着重要的意义。基于此,本研究连续三年监测我国不同水稻产区褐飞虱田间种群对噻虫胺的抗性水平;基于室内噻虫胺抗性选育获得的噻虫胺抗性品系褐飞虱,系统研究了其交互抗性谱、抗性遗传方式及抗性适合度代价,采用生理生化和分子生物学技术,深入探讨了褐飞虱对噻虫胺代谢抗性机制。主要结果如下:1.我国褐飞虱田间种群对噻虫胺抗性监测于2018-2020年连续三年监测了我国7省14个地区褐飞虱田间种群对噻虫胺抗性水平。结果表明,褐飞虱田间种群已对噻虫胺产生中等至高水平抗性,其中20个种群(76.92%)为高水平抗性,6个种群(23.08%)为中等水平抗性,且褐飞虱田间种群对噻虫胺的抗性呈明显的逐年上升趋势。2.褐飞虱对噻虫胺抗性生化机制及相关生物学特性基于室内敏感品系CLS,通过连续多代药剂筛选获得抗噻虫胺褐飞虱品系CLR(G12,RR=199.09)。交互抗性谱显示,噻虫胺与吡虫啉、噻虫嗪、烯啶虫胺、呋虫胺、氟啶虫胺腈、环氧虫啶以及异丙威均存在交互抗性,而与噻嗪酮、毒死蜱以及三氟苯嘧啶未呈现交互抗性。通过抗性品系CLR和敏感品系CLS正反交实验,发现褐飞虱对噻虫胺的抗性是由常染色体控制的不完全显性遗传。F1代经自交和回交得到的F2代经噻虫胺处理后死亡率的期望值与实际值间存在显著差异,表明褐飞虱对噻虫胺的抗性由多基因控制。通过两性生命表比较具有相同遗传背景的褐飞虱品系CLS与CLR,结果表明,与CLS品系相比,褐飞虱抗噻虫胺品系四龄若虫发育历期和成虫产卵前期APOP显著延长,雌成虫繁殖力显著下降,相对适合度为0.78,表明褐飞虱对噻虫胺的抗性存在适合度代价。增效剂实验表明仅CLR品系中胡椒基丁醚PBO对噻虫胺有增效作用;抗、敏品系褐飞虱若虫解毒酶比活力测定结果也表明,仅细胞色素P450多功能氧化酶活性在CLR品系中显著增强,表明P450在褐飞虱对噻虫胺抗性中发挥关键作用。3.褐飞虱抗噻虫胺相关P450基因鉴定比较转录组分析结果表明共1878个转录本在褐飞虱对噻虫胺抗、敏品系中差异表达,其中1169个转录本在CLR文库中显著高表达,709个转录本在CLR文库中显著低表达。通过实时荧光定量PCR对褐飞虱54个P450基因表达量进行分析,发现CYP6ER1在CLR品系中显著过量表达,且上调倍数达14.25倍,与RNA-seq一致。RNAi结果表明,当CLR品系CYP6ER1表达被沉默后,褐飞虱对噻虫胺敏感性显著恢复,证实CYP6ER1在褐飞虱对噻虫胺抗性形成中具有重要作用。进一步研究表明抗性品系CYP6ER1可编码两种多态性序列的转录本,但过表达不同变体的转基因果蝇对噻虫胺敏感性无明显差异,表明室内抗性品系中CYP6ER1多态性对噻虫胺抗性可能不存在作用。4.褐飞虱抗噻虫胺品系CYP6ER1过表达的转录调控机制为探究CYP6ER1过表达的转录调控机制,构建了6个不同长度的CYP6ER1启动子瞬时表达载体并检测其荧光活性,结果表明CYP6ER1启动子-1388 bp-1208 bp是转录因子重要结合区域。基于在线软件预测,比较转录因子Nl AP-1、Nl BR-C、Nl Cnc C、Nl CEBP及Nl Maf K在抗性与敏感品系的表达量,筛选出转录因子Nl AP-1在褐飞虱抗噻虫胺品系中显著过量表达。抗性品系干扰Nl AP-1后,褐飞虱对噻虫胺敏感性显著恢复且CYP6ER1表达显著下调。进一步的启动子活性实验证明Nl AP-1可显著增强CYP6ER1的启动子活性,并且两个预测的结合位点都可以与Nl AP-1作用,研究结果从转录水平上阐述了褐飞虱对噻虫胺抗性品系中CYP6ER1过表达的调控机制。以上研究为揭示褐飞虱对噻虫胺代谢抗性的分子机制及其调控机制提供了理论依据。
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