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东方粘虫Mythimaseparata是禾本科作物的重要害虫，雌虫单头产卵量高达800-1000粒，对作物的潜在危害十分严重。昆虫通过嗅觉识别环境中的各类气味物质，如性信息素、植物挥发物，从而确定种内交配对象、栖息或产卵场所，嗅觉在昆虫行为中扮演重要角色。气味结合蛋白OBPs(含信息素结合蛋白PBPs)被认为在嗅觉识别过程中运输气味分子方面起着一定作用，参与信息化学物质感知的初始生化识别过程；PBPs起初被认为主要识别性信息素分子，还可以提高性信息素分子与其受体间的结合率，但越来越多的研究表明，PBPs还可以与寄主植物挥发物等结合；一些OBPs被发现既可以与寄主植物挥发物结合，又可以与昆虫性信息素分子结合。PBPs在不同昆虫中的生理功能还不是很清晰。为此，本文拟在观察重要害虫东方粘虫触角嗅觉感器形态的基础上，构建了其触角转录组，分析了OBPs/PBPs基因的时空表达特性，测定了东方粘虫重组PBPs与性信息素分子等气味物质的结合特性，探讨了PBPs在东方粘虫求偶行为过程中的作用，以期探明东方粘虫PBPs的生理功能。主要研究结果如下：
1触角感器的超微结构
采用扫描电镜观察了东方粘虫触角表面的超微形态。结果表明，东方粘虫触角表面有刺形感器、毛形感器、锥形感器、腔锥形感器等7种嗅觉感器。其中毛形感器为数量最多的嗅觉感器，感器壁厚且有微孔。毛形感器可以分为3个亚型，包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型毛形感器，且表现出明显的雌、雄二型现象；雄虫Ⅰ型毛形感器总数量显著高于雌虫，雄虫Ⅰ型毛形感器外观呈“S”型，成簇排列成3-4列，每节感器自触角侧面向腹面中部逐渐变短，而雌虫触角上Ⅰ型毛形感器排列没有规律；雌虫Ⅱ、Ⅲ型毛形感器的数量显著高于雄虫。锥形感器壁薄且多微孔显著区别于毛形感器，其有2个亚型，雄虫Ⅰ型锥形感器数量显著高于雌虫，而雄虫Ⅱ型锥形感器数量显著低于雌虫。腔锥形感器外观呈菊花状，雄虫感器数量显著高于雌虫。其他类型感器的形态或数量无显著的雌雄差异。
2嗅觉相关蛋白候选基因的鉴定
通过采集东方粘虫触角并进行转录组测序，共鉴定出130条嗅觉相关候选基因，包括32个气味结合蛋白(OBPs)基因，16个化学感受蛋白(CSPs)基因，71个气味受体蛋白(ORs)基因，8个离子受体蛋白(IRs)基因，1个味觉受体蛋白(GR)基因和2个跨膜蛋白(SNMPs)基因。除了MsepOBP23，MsepOR1.1，MsepOR3.1和MsepOR71等几个基因外，其他126个都是新报道的东方粘虫嗅觉相关基因。共获得4个东方粘虫性信息素结合蛋白(MsepPBPs)候选基因：MsepPBP1(JAV45890.1，MsepOBP23)，MsepPBP2(JAV45910.1，MsepOBP3)，MsepPBP3(JAV45887.1，MsepOBP26)和MsepPBP4(JAV45904.1，MsepOBP9)。这4个蛋白均具典型OBPs特征，有6个保守的半胱氨酸位点。MsepPBP1~MsepPBP4的氨基酸数量、分子量、等电点分别170，19.1KD，5.49；165，18.3KD，5.46；164，18.6KD，5.46；146，15.7KD，5.32。同源比对发现，MsepPBP1与东方粘虫日本种群MsepPBP(BAG71416.1 )一致性达到98%；MsepPBP2与棉铃虫HarmPBP(AEB54583.1)一致性达到77%；MsepPBP3与小地老虎AipsPBP(AFM36758.1 )一致性达到86%；MsepPBP4与甘蓝夜蛾MbraPBP(AAL66739.1)一致性达到84%。
3东方粘虫OBPs/PBPs候选基因时空表达特点
利用qPCR测定了东方粘虫7个MsepOBPs(MsepOBP5、MsepOBP7、MsepOBP19、MsepOBP20、MsepOBP22、MsepOBP24和MsepOBP26)及4个MsepPBPs(MsepPBP1~MsepPBP4)在雌雄虫不同组织及不同日齢的表达量。结果表明，MsepOBP/PBPs均未表现出明显的雌虫或雄虫特异性，但存在一定的时间和空间表达的特异性。
空间表达特点：7个MsepOBPs中MsepOBP5，MsepOBP7,MsepOBP22,MsepOBP24和MsepOBP26均在触角内表达量显著高于头(不含触角)、胸、腹、足、和翅等器官；MsepOBP20在触角的表达量低于其他器官，MsepOBP19在各器官普遍均广泛表达，且在1d成虫翅上表达量尤其高。MsepPBP1、MsepPBP2、MsepPBP3具有触角表达特异性，但是MsepPBP4除在触角外，在其他器官如胸部、腹部、老熟幼虫头部(含触角)、翅及足中均有少量表达。
时间表达特点：7个MsepOBPs中除MsepOBP24在不同日龄成虫触角上表达量无显著差异外，其他基因在不同日龄成虫上的表达量均有显著差异。MsepOBP5,MsepOBP7,MsepOBP22,MsepOBP26在1d及3d雄虫触角中显著高于其他日龄雄虫；MsepOBP19在0d雄虫触角等器官的表达量也显著高于其他日龄成虫；MsepOBP20在触角等器官的表达量无日龄显著差异；MsepOBP26在1d雌虫触角中表达量显著低于其他日龄雌虫。MsepPBP1、MsepPBP2、MsepPBP3在3d雄虫的表达量高于其他日龄，这与雌虫2d-3d的求偶前期一致；MsepPBP4随成虫日龄的增加，表达量降低。雌虫中4个MsepPBPs无时间特异性表达规律。
4MsepPBPs原核表达及功能分析
构建了重组载体MsepPBPs-pATX-sumo，在原核系统E.coli(EC+)中成功表达，经镍离子亲和柱纯化后成功获得了3个体外重组蛋白MsepPBP1、MsepPBP3、MsepPBP4。
利用荧光竞争结合试验及荧光猝灭试验对重组蛋白MsepPBPs与东方粘虫性信息素组分、雄虫EAG反应强烈物质和普通气味物质的结合能力进行了测定。结果表明，MsepPBPs对性信息素的结合有一定的专一性，而并非广泛结合大量气味物质。荧光竞争结合试验发现，MsepPBP1、MsepPBP3与性信息素组分(Z11-16:Ald、16:Ald、Z11-16:OH、Z9-16:Ald、Z11-16:Ac)，以及雄虫EAG反应强烈物质((E,Z)-2,6-壬二烯醛、苯乙醇、E-2-壬烯醛)和普通气味物质(月桂烯、芳樟醇、苯甲醛、Z-3-己醇)均具有较强的结合能力，且MsepPBP3与东方粘虫性信息素主要组分Z11-16:Ald结合力最强，其Ki值为1.35μM；而MsepPBP4与性信息素微量组分16:Ald和Z11-16:Ac(Ki分别为4.73μM和2.34μM)，以及雄虫EAG反应强烈物质和普通气味物质(Ki为5.48μM-8.33μM)均具有较强的结合能力，但与Z11-16:Ald几乎无明显的结合特性(Ki>50μM)。
但是荧光猝灭试验表明，MsepPBP1只与Z9-16:Ald、月桂烯、顺-3-己烯醇等化合物发生猝灭反应，且Stern-volmer方程斜率显示，MsepPBP1只与Z9-16:Ald为静态结合；分子对接结果表明，Z9-16:Ald以氢键与MsepPBP1的111号赖氨酸结合。MsepPBP3只与Z11-16:Ald、Z9-16:Ald、Z11-16OH、月桂烯、顺-3-己烯醇等化合物与发生猝灭反应，且Stern-volmer方程斜率显示MsepPBP3只与Z11-16:Ald、Z9-16:Ald为静态结合，分子对接结果表明，Z11-16Ald与MsepPBP3的37号色氨酸以氢键结合，Z9-16Ald与MsepPBP3的110号精氨酸以氢键结合。无化合物与MsepPBP4发生猝灭反应。
利用RNAi探讨了与性信息素发生静态结合的MsepPBP1及MsepPBP3在东方粘虫求偶行为中的作用。结果发现，MsepPBP1干扰后，雄虫MsepPBP1表达量为对照的4.12%；对MsepPBP3干扰后，雄虫MsepPBP3表达量为对照的53.48%。通过行为观察平台发现，这两种基因受干扰雄虫第一次逆风飞翔前的静止时间分别为498.67±286.21min，490.47±214.87min，显著长于对照14.95±7.97min；对照雄虫100%出现飞翔行为，20%的雄虫飞翔但不交配，80%的雄虫飞翔且交配；MsepPBP1干扰后20%的雄虫没有飞翔行为，60%的雄虫飞翔但不交配，20%的雄虫飞翔且交配；MsepPBP3干扰后5%的雄虫没有飞翔行为，80%的雄虫飞翔但不交配，15%的雄虫飞翔且交配。MsepPBP1及MsepPBP3干扰后，雄虫对雌虫的敏感性降低。MsepPBP1及MsepPBP3对于提高东方粘虫雄虫对性信息素分子的敏感性可能起到重要的作用。
综上，试验表明，MsepPBP3可能是东方粘虫感受性信息素分子的关键蛋白，MsepPBP1、MsepPBP3对性信息素分子具有一定的专一性，这两个蛋白对于提高东方粘虫雄虫对性信息素分子的敏感性可能起到重要的作用。这些结果为深入理解昆虫识别性信息素的分子机制及性信息素的田间应用提供了理论参考，为进一步阐释东方粘虫性信息素结合蛋白的功能提供了数据支撑。
1触角感器的超微结构
采用扫描电镜观察了东方粘虫触角表面的超微形态。结果表明，东方粘虫触角表面有刺形感器、毛形感器、锥形感器、腔锥形感器等7种嗅觉感器。其中毛形感器为数量最多的嗅觉感器，感器壁厚且有微孔。毛形感器可以分为3个亚型，包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型毛形感器，且表现出明显的雌、雄二型现象；雄虫Ⅰ型毛形感器总数量显著高于雌虫，雄虫Ⅰ型毛形感器外观呈“S”型，成簇排列成3-4列，每节感器自触角侧面向腹面中部逐渐变短，而雌虫触角上Ⅰ型毛形感器排列没有规律；雌虫Ⅱ、Ⅲ型毛形感器的数量显著高于雄虫。锥形感器壁薄且多微孔显著区别于毛形感器，其有2个亚型，雄虫Ⅰ型锥形感器数量显著高于雌虫，而雄虫Ⅱ型锥形感器数量显著低于雌虫。腔锥形感器外观呈菊花状，雄虫感器数量显著高于雌虫。其他类型感器的形态或数量无显著的雌雄差异。
2嗅觉相关蛋白候选基因的鉴定
通过采集东方粘虫触角并进行转录组测序，共鉴定出130条嗅觉相关候选基因，包括32个气味结合蛋白(OBPs)基因，16个化学感受蛋白(CSPs)基因，71个气味受体蛋白(ORs)基因，8个离子受体蛋白(IRs)基因，1个味觉受体蛋白(GR)基因和2个跨膜蛋白(SNMPs)基因。除了MsepOBP23，MsepOR1.1，MsepOR3.1和MsepOR71等几个基因外，其他126个都是新报道的东方粘虫嗅觉相关基因。共获得4个东方粘虫性信息素结合蛋白(MsepPBPs)候选基因：MsepPBP1(JAV45890.1，MsepOBP23)，MsepPBP2(JAV45910.1，MsepOBP3)，MsepPBP3(JAV45887.1，MsepOBP26)和MsepPBP4(JAV45904.1，MsepOBP9)。这4个蛋白均具典型OBPs特征，有6个保守的半胱氨酸位点。MsepPBP1~MsepPBP4的氨基酸数量、分子量、等电点分别170，19.1KD，5.49；165，18.3KD，5.46；164，18.6KD，5.46；146，15.7KD，5.32。同源比对发现，MsepPBP1与东方粘虫日本种群MsepPBP(BAG71416.1 )一致性达到98%；MsepPBP2与棉铃虫HarmPBP(AEB54583.1)一致性达到77%；MsepPBP3与小地老虎AipsPBP(AFM36758.1 )一致性达到86%；MsepPBP4与甘蓝夜蛾MbraPBP(AAL66739.1)一致性达到84%。
3东方粘虫OBPs/PBPs候选基因时空表达特点
利用qPCR测定了东方粘虫7个MsepOBPs(MsepOBP5、MsepOBP7、MsepOBP19、MsepOBP20、MsepOBP22、MsepOBP24和MsepOBP26)及4个MsepPBPs(MsepPBP1~MsepPBP4)在雌雄虫不同组织及不同日齢的表达量。结果表明，MsepOBP/PBPs均未表现出明显的雌虫或雄虫特异性，但存在一定的时间和空间表达的特异性。
空间表达特点：7个MsepOBPs中MsepOBP5，MsepOBP7,MsepOBP22,MsepOBP24和MsepOBP26均在触角内表达量显著高于头(不含触角)、胸、腹、足、和翅等器官；MsepOBP20在触角的表达量低于其他器官，MsepOBP19在各器官普遍均广泛表达，且在1d成虫翅上表达量尤其高。MsepPBP1、MsepPBP2、MsepPBP3具有触角表达特异性，但是MsepPBP4除在触角外，在其他器官如胸部、腹部、老熟幼虫头部(含触角)、翅及足中均有少量表达。
时间表达特点：7个MsepOBPs中除MsepOBP24在不同日龄成虫触角上表达量无显著差异外，其他基因在不同日龄成虫上的表达量均有显著差异。MsepOBP5,MsepOBP7,MsepOBP22,MsepOBP26在1d及3d雄虫触角中显著高于其他日龄雄虫；MsepOBP19在0d雄虫触角等器官的表达量也显著高于其他日龄成虫；MsepOBP20在触角等器官的表达量无日龄显著差异；MsepOBP26在1d雌虫触角中表达量显著低于其他日龄雌虫。MsepPBP1、MsepPBP2、MsepPBP3在3d雄虫的表达量高于其他日龄，这与雌虫2d-3d的求偶前期一致；MsepPBP4随成虫日龄的增加，表达量降低。雌虫中4个MsepPBPs无时间特异性表达规律。
4MsepPBPs原核表达及功能分析
构建了重组载体MsepPBPs-pATX-sumo，在原核系统E.coli(EC+)中成功表达，经镍离子亲和柱纯化后成功获得了3个体外重组蛋白MsepPBP1、MsepPBP3、MsepPBP4。
利用荧光竞争结合试验及荧光猝灭试验对重组蛋白MsepPBPs与东方粘虫性信息素组分、雄虫EAG反应强烈物质和普通气味物质的结合能力进行了测定。结果表明，MsepPBPs对性信息素的结合有一定的专一性，而并非广泛结合大量气味物质。荧光竞争结合试验发现，MsepPBP1、MsepPBP3与性信息素组分(Z11-16:Ald、16:Ald、Z11-16:OH、Z9-16:Ald、Z11-16:Ac)，以及雄虫EAG反应强烈物质((E,Z)-2,6-壬二烯醛、苯乙醇、E-2-壬烯醛)和普通气味物质(月桂烯、芳樟醇、苯甲醛、Z-3-己醇)均具有较强的结合能力，且MsepPBP3与东方粘虫性信息素主要组分Z11-16:Ald结合力最强，其Ki值为1.35μM；而MsepPBP4与性信息素微量组分16:Ald和Z11-16:Ac(Ki分别为4.73μM和2.34μM)，以及雄虫EAG反应强烈物质和普通气味物质(Ki为5.48μM-8.33μM)均具有较强的结合能力，但与Z11-16:Ald几乎无明显的结合特性(Ki>50μM)。
但是荧光猝灭试验表明，MsepPBP1只与Z9-16:Ald、月桂烯、顺-3-己烯醇等化合物发生猝灭反应，且Stern-volmer方程斜率显示，MsepPBP1只与Z9-16:Ald为静态结合；分子对接结果表明，Z9-16:Ald以氢键与MsepPBP1的111号赖氨酸结合。MsepPBP3只与Z11-16:Ald、Z9-16:Ald、Z11-16OH、月桂烯、顺-3-己烯醇等化合物与发生猝灭反应，且Stern-volmer方程斜率显示MsepPBP3只与Z11-16:Ald、Z9-16:Ald为静态结合，分子对接结果表明，Z11-16Ald与MsepPBP3的37号色氨酸以氢键结合，Z9-16Ald与MsepPBP3的110号精氨酸以氢键结合。无化合物与MsepPBP4发生猝灭反应。
利用RNAi探讨了与性信息素发生静态结合的MsepPBP1及MsepPBP3在东方粘虫求偶行为中的作用。结果发现，MsepPBP1干扰后，雄虫MsepPBP1表达量为对照的4.12%；对MsepPBP3干扰后，雄虫MsepPBP3表达量为对照的53.48%。通过行为观察平台发现，这两种基因受干扰雄虫第一次逆风飞翔前的静止时间分别为498.67±286.21min，490.47±214.87min，显著长于对照14.95±7.97min；对照雄虫100%出现飞翔行为，20%的雄虫飞翔但不交配，80%的雄虫飞翔且交配；MsepPBP1干扰后20%的雄虫没有飞翔行为，60%的雄虫飞翔但不交配，20%的雄虫飞翔且交配；MsepPBP3干扰后5%的雄虫没有飞翔行为，80%的雄虫飞翔但不交配，15%的雄虫飞翔且交配。MsepPBP1及MsepPBP3干扰后，雄虫对雌虫的敏感性降低。MsepPBP1及MsepPBP3对于提高东方粘虫雄虫对性信息素分子的敏感性可能起到重要的作用。
综上，试验表明，MsepPBP3可能是东方粘虫感受性信息素分子的关键蛋白，MsepPBP1、MsepPBP3对性信息素分子具有一定的专一性，这两个蛋白对于提高东方粘虫雄虫对性信息素分子的敏感性可能起到重要的作用。这些结果为深入理解昆虫识别性信息素的分子机制及性信息素的田间应用提供了理论参考，为进一步阐释东方粘虫性信息素结合蛋白的功能提供了数据支撑。