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目的:乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,根据2018年国际癌症研究机构发布的全球癌症数据统计结果,乳腺癌的发病率在所有女性癌症患者中排名第一,约占女性肿瘤的24%。相对于其他类型癌症来说,乳腺癌尽管预后较好,但仍有15%的乳腺癌患者发生死亡。近年来乳腺癌发病率和死亡率呈现上升趋势,乳腺癌已经成为40～55岁女性死亡的头号杀手。目前,早期乳腺癌的治愈率可高达80～90%,而晚期乳腺癌则小于40%。三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer,TNBC）是指癌组织免疫组织化学检查结果为雌激素受体（estrogen receptor,ER）、孕激素受体（progesterone receptor,PR）和人表皮生长因子受体-2（human epidermal growth factor receptor-2,Her-2）均为阴性的乳腺癌。这类乳腺癌具有特殊的生物学行为和临床病理学特征。相对于非三阴性乳腺癌来说,TNBC具有平均发病年龄小、侵袭性强、转移性强、生存率低、死亡率和局部复发率高等特点。TNBC目前的治疗手段仍然是以局部手术为主并辅助以全身放疗和/或放疗。对于TNBC,目前缺乏明确的分子靶点,标准化治疗下的TNBC更容易发生远处转移,预后较其他亚型乳腺癌患者差。虽然TNBC通常对化疗有很高的反应率,但它们经常产生化疗耐药性。因此,通过阐明耐药机制,寻找新的分子靶点和开发新的策略是至关重要的。研究方法:1.采用生物信息学方法和免疫组织化学染色方法检测三阴性乳腺癌患者和非三阴性乳腺癌患者组织中卷曲蛋白-5（Frizzled-5,FZD5）的表达情况;利用Kaplan Meier网站分析乳腺癌患者FZD5的表达情况与生存时间的关系。2.选取MDA-MB-231和Hs-578t三阴性乳腺癌细胞,分别构建MDA-MB-231稳转FZD5敲减细胞系和Hs-578t稳转FZD5过表达细胞系;采用CCK8方法和克隆形成实验检测FZD5对三阴性乳腺癌细胞体外增殖能力的影响;采用MDA-MB-231细胞进行裸鼠荷瘤实验并对形成的瘤体进行免疫组织化学染色检测Ki67和p-H3的表达情况,以检测FZD5对体内增殖能力的影响。3.采用流式细胞技术,检测各组MDA-MB-231和Hs-578t细胞周期情况,以分析FZD5对三阴性乳腺癌细胞周期的影响;采用western blot方法检测CDK2、Cyclin E2、Cyclin A2蛋白的表达情况,以探讨FZD5对细胞周期调控的机制;采用EDU染色实验探讨FZD5对三阴性乳腺癌细胞增殖的影响。4.采用免疫荧光实验方法检测经阿霉素（Adriamycin,ADR）诱导后的各组MDA-MB-231和Hs-578t细胞的细胞核中γ-H2AX的表达情况,以探讨FZD5对三阴性乳腺癌细胞DNA损伤修复的影响;采用real-time PCR方法检测DNA损伤调控相关因子EXO1、PLK4和RFC4的m RNA表达情况,以探讨FZD5对三阴性乳腺癌细胞DNA损伤修复的调控机制;给予MDA-MB-231和Hs-578t细胞ADR及紫杉醇（Paclitaxel）处理48h,采用流式细胞技术探讨FZD5对三阴性乳腺癌细胞凋亡的影响。5.采用real-time PCR方法检测干性标记物CD133、EPCAM、ALDH1A2和干性转录因子POU5F1的m RNA表达情况,采用流式细胞技术检测细胞中干性标记物CD133、EPCAM和ALDH1A2阳性细胞的比例,采用肿瘤细胞成球实验检测各组细胞形成肿瘤细胞球的能力,以探讨FZD5对肿瘤细胞干性特征的影响。6.采用CCLE数据库分析FOXM1、BRCA1和BIRC5与FZD5的相关性,BRCA1和BIRC5与FOXM1的相关性,采用western blot方法检测FOXM1、BRCA1、BIRC5和β-catenin的蛋白表达情况;采用染色质免疫共沉淀检测FOXM1与BRCA1和BIRC5启动子的结合情况;Hs-578t细胞过表达FOXM1,采用western blot方法检测FOXM1、BRCA1和BIRC5蛋白的表达情况;给予不同浓度（0、1、10μM）的β-catenin蛋白抑制剂XAV939处理MDA-MB-231细胞后,采用western blot方法检测其FOXM1蛋白表达情况。7.在MDA-MB-231细胞中敲减FZD5后,再转染FOXM1过表达质粒,在Hs-578t细胞中过表达FOXM1,采用CCK8方法检测FZD5对各组细胞的细胞活力;采用流式细胞技术检测FZD5对各组细胞的细胞周期的影响;给予300n M ADR 48h采用免疫荧光染色方法检测FZD5对各组细胞的细胞核中γ-H2AX的表达情况;采用肿瘤细胞成球实验检测FZD5对各组细胞干性特征的影响;8.选取MDA-MB-231细胞,采用慢病毒感染（sh Ctrl和sh Wnt7B-1/2）来敲减Wnt7B基因,形成稳转细胞系,采用CCK8方法分别检测Wnt7B对细胞活力的影响;采用流式细胞技术检测Wnt7B对细胞周期分布的影响;给予300n M ADR 48h采用免疫荧光染色方法检测Wnt7B对各组细胞的细胞核中γ-H2AX的表达情况;采用肿瘤细胞成球实验检测Wnt7B对各组细胞干性特征的影响;结果:1.TCGA数据库和GEO数据库结果显示FZD5在三阴性乳腺癌中高表达,且免疫组织化学结果进一步证实了FZD5在人三阴性乳腺癌中高表达。FZD5高表达的乳腺癌患者预后较差。2.CCK8和克隆实验结果显示FZD5能够促进细胞活力和克隆形成能力小鼠荷瘤实验结果显示FZD5能够促进裸鼠体内形成肿瘤,免疫组化结果显示肿瘤组织中p-H3与Ki67阳性细胞数目较少。3.细胞周期结果显示FZD5促进细胞由G1期进入S期;western blot结果显示FZD5能够促进细胞周期相关蛋白CDK2、Cyclin E2和Cyclin A2的表达;EDU结果显示FZD5敲减后的EDU阳性细胞数目显著降低,相反FZD5过表达后,EDU阳性细胞数目显著升高。4.免疫荧光结果显示FZD5能够促进细胞核中γ-H2AX的表达;real-time PCR结果显示FZD5能够促进EXO1、PLK4和RFC4的m RNA表达水平;凋亡实验结果显示,在给与ADR及Paclitaxel诱导细胞凋亡后,FZD5能够抑制细胞发生凋亡。5.real-time PCR结果显示FZD5能够促进CD133、EPCAM、ALDH1A2和POU5F1的m RNA表达;流式结果显示FZD5能够促进CD133、EPCAM和ALDH1蛋白表达;肿瘤细胞成球实验显示FZD5能够促进肿瘤细胞球的形成。6.CCLE数据库相关性分析结果显示FZD5与FOXM1、BRCA1与FZD5、BRCA1与FOXM1、BIRC5与FZD5、BIRC5与FOXM1均呈现显著正相关性;western blot结果显示FZD5能够促进BRCA1和BIRC5蛋白表达;免疫共沉淀结果显示FOXM1能够与BRCA1和BIRC5启动子特定序列结合;western blot结果显示FOXM1能够促进BRCA1、BIRC5蛋白表达、FZD5能够促进活化的β-catenin蛋白表达、β-catenin蛋白抑制剂（XAV939）能够抑制FOXM1蛋白表达。7.FOXM1挽救实验结果显示,FOXM1能够促进细胞活力、能够促进细胞由G1期向S期转换、能够促进细胞核中γ-H2AX的表达、能够促进细胞形成肿瘤细胞球。8.细胞周期结果显示Wnt7B能够促进细胞由G1期向S期转换、能够促进细胞核中γ-H2AX的表达;能够促进细胞形成肿瘤细胞球。结论:1.FZD5能促进三阴性乳腺癌的G1/S期转换,DNA复制、DNA损伤修复、耐药及干性。2.Wnt7B/FZD5,通过经典的Wnt通路（Wnt/β-catenin）调控FOXM1的表达。3.FOXM1作为FZD5的下游分子能够转录性调控BIRC5和BRCA1,进而调控三阴性乳腺癌细胞G1/S期转换,DNA复制、DNA损伤修复、耐药及干性。