胸腺肽β4(thymosin β4)是由43个氨基酸残基构成的酸性小分子多肽,属于p胸腺肽家族,分子量4982Da,等电点为5.1,N端丝氨酸乙酰化,分子结构中含有2个a螺旋结构,分别位于第4-16和第30-40氨基酸残基之间。现有的研究证实,胸腺肽β4具有多种生物学功能,在细胞黏附和移行、组织损伤与修复、血管形成、炎症反应、细胞凋亡等生理和病理过程中均发挥重要的调控作用,因此具有广阔的药用前景。目前胸腺肽p4的获得主要靠生物提取和化学合成,但生物提取很难获得成分单一的胸腺肽β4,而化学合成昂贵的成本限制了其药用前景。胸腺肽p4的cDNA序列和氨基酸序列都已明确,为利用基因工程方法生产胸腺肽β4提供了基础,但胸腺肽p4相对分子质量仅有4982Da,在表达宿主菌中易被降解而很难实现高效表达,大大限制了其产业化。为克服上述问题,本研究基于融合蛋白设计理念,依据大肠杆菌密码子使用偏好对人胸腺肽β4密码子进行优化,人工合成密码子经过优化、单倍体编码基因间由柔性接头序列连接在一起的串联三倍体人胸腺肽β4编码基因；利用基因合成时引入基因上游的核酸限制性内切酶NcoI和引入基因下游的核酸限制性内切酶XhoI从克隆载体中切出串联三倍体人胸腺肽β4编码基因,经切胶回收后与同样经NcoI和XhoI线性化的大肠杆菌表达载体pET22b(+)于16℃连接重组。连接产物转化大肠杆菌Top10感受态细胞,经酶切检测和序列分析鉴定筛选出正确重组的串联三倍体人胸腺肽p4原核表达载体。用乳糖诱导串联三倍体人胸腺肽β4编码基因在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,SDS-PAGE电泳检测结果显示,重组串联三倍体人胸腺肽p4可在乳糖诱导下以可溶性蛋白形式在宿主菌BL21(DE3)中高效表达,表达产物占宿主细胞可溶性蛋白的28%。诱导处理的菌体裂解液经高温煮沸去除大部分杂蛋白,所得粗纯化菌体裂解上清液经进一步His-tag高亲和性Ni柱亲和层析,获得纯度达到92%以上的蛋白质样品。玫瑰花环实验、淋巴细胞增殖实验以及小鼠毛发再生实验结果表明,重组串联三倍体人胸腺肽β4具有促进淋巴细胞增殖,增加细胞移行能力,激活毛囊等生物学活性。