【摘 要】
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果糖及其果糖基衍生产品因其独特的甜度与生理保健功能,在医药、食品、保健品以及饲料行业具有很好的应用前景。工业上以蔗糖、菊粉为原料,利用果糖基水解酶系(蔗糖酶,菊粉酶
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果糖及其果糖基衍生产品因其独特的甜度与生理保健功能,在医药、食品、保健品以及饲料行业具有很好的应用前景。工业上以蔗糖、菊粉为原料,利用果糖基水解酶系(蔗糖酶,菊粉酶)来生产果糖及其果糖基衍产品。本文通过分子生物学技术对黑曲霉基因组中的两种果糖基水解酶进行克隆、表达及其酶学性质分析,为果糖基水解酶基因水平的改造和果糖及其果糖基衍产品的工艺研究提供参考。利用生物信息学的方法分析了黑曲霉基因组数据库,获得了相关果糖基酶的候选基因,通过对氨基酸序列的分析比对及3-D同源结构的模拟,选出了 5个果糖基水解酶基因fru1,fru2,fru3,fru4和fru5,其中fru1,fru2,fru3是蔗糖酶基因,fru4和fru5为菊粉酶基因。本研究提取黑曲霉总RNA,反转录得其cDNA,以此为模板进行了基因克隆,构建重组毕赤酵母。检测重组酶的酶活,Pichiapastoris GS115/pPIC9K-fru2,P.pastoris GS115/pPIC9K-fru3 和P.pastoris GS115/pPIC9K-fru4 检测不到酶活;而P.pastoris AGS115/pPIC9K-fru1 与P.pastoris GS115/pPIC9K-fru5 酶活较高,分别为 1360.06 U/mL,1560.34 U/mL。进一步对重组酶Fru1与Fru5的酶学性质进行分析研究。Fru1的最适反应pH和最适反应温度分别是5.5和45℃,在pH 4.0～6.0的偏酸环境下或30℃～45℃的温度范围内该酶的稳定性较好。EDTA对其有促进作用,Fe2+、Na+、Co2+、Cu2+、Ca2+对该酶有一定抑制作用,Fru1对蔗糖和菊粉有水解作用;Fru5的最适pH和最适作用温度分别为5.0和50℃,在pH 5.0～6.0条件下或40℃～50℃温度范围内较稳定。Li+、Na+、EDTA对其有促进作用,Fe2+严重抑制酶的活性,Fru5对蔗糖和菊粉有水解作用。
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