论文部分内容阅读
背景和目的结核病是由结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis,MTB）引起的慢性潜在致命性传染病,是单一感染因子致死的主要原因（排在HIV/AIDS之上）。2019年,全球估计1000万人感染结核病。HIV阴性的人群中有120万人死于结核病,HIV阳性人群中有20.8万人死于结核病[1]。当结核病患者将结核菌排入空气时就会扩散,除了引起肺结核,亦可以引起肺外结核。结核病一般好发在免疫功能低下,合并糖尿病、尘肺等人群。对于敏感型初治肺结核患者,临床上使用异烟肼（INH）、利福平（RIF）、吡嗪酰胺（PZA）和乙胺丁醇（EMB）组成标准化一线抗结核治疗方案,总疗程至少六个月[2]。肠道微生态是人体重要的微生态系统,其微生物种类繁多,最为复杂,单从细菌而言,主要由厚壁菌、拟杆菌、放线菌和变形杆菌4个门类的细菌组成,自门以下还可按照纲、目、科、属和种进行分类,超过1000个种类,肠道中的微生物除了调节肠道功能,还在机体的物质代谢、内分泌调节、衰老、生长发育等多个方面起着核心作用[3][4]。研究表明益生菌、益生元和合生元等营养制剂通过改善肠道微环境达到改善疾病状况的效果。抗结核治疗需要长时间使用抗生素,异烟肼、吡嗪酰胺、乙胺丁醇常常认为专门针对分枝杆菌,而利福类药物则是一种广谱抗生素。如此长疗程的抗生素使用,必将对肠道菌群产生影响。国内外已有研究表明,结核药的单药治疗及药物间的不同组合对肠道微生物的相对丰度及菌群多样性分别产生不同的影响。但许多结果限于实验室建模,或单纯研究某一治疗阶段的影响。本研究纵向分析抗结核治疗各阶段的肠道菌群变化,研究结果为该领域研究提供数据。通过不同菌群富集区分健康人群及患者,通过补充不同菌种减少不良反应、提高医从性及肺结核治愈率。材料和方法1.肺结核患者入组和粪便收集流程本研究招募广州市胸科医院68名志愿者,纳入标准:1)符合临床诊疗指南菌阳肺结核初治诊断标准[2];2)接受标准异烟肼、利福平、吡嗪酰胺、乙胺丁醇方案治疗的患者（如出现明显胃肠道反应,利福平可调整为利福喷汀[5][6]）;3)年龄大于等于18周岁;4)治疗前2月未使用过抗生素治疗;5)所有受试者均为HIV阴性;6)签署书面知情同意书。排除标准:1)诊断为胃肠道疾病;2)严重肝肾功能不全或疾病;3)糖尿病;4)长期使用全身激素或免疫抑制剂者;5)DST确认为耐药结核病;6)怀孕。这项研究得到地方伦理委员会（编号:中大公卫医伦[2019]第063号）的批准,并获得所有参与者的书面知情同意。样本采集:使用《粪便微生物基因组保护液套装》（LS-R-P-003,Longsee）,按照产品说明进行采样,采取新鲜粪便样本后立刻送实验室-20℃储存直至DNA提取2.方法2.1粪便样本菌群核酸提取:按照《粪便微生物基因组DNA提取试剂盒》（LS-R-N-015,Longsee）操作说明提取粪便菌群DNA。2.2 16S rDNA测序文库构建和测序。2.3对Illumina Miseq测序数据进行分析。结果1.规则抗结核治疗1周与健康对照组患者的肠道微生物对比,Alpha多样性Chao1指数为（124±62）,低于健康对照组（205±40）,P＜0.001,差异有统计学意义。Beta多样性中基于加权和未加权UniFrac距离绘制的PCoA散点图显示两组在菌种结构上有显著差异,P=0.001。2.规则完成强化期治疗患者与健康对照组肠道菌群对比,抗结核治疗组Alpha多样性Chao1指数为（136±49）,低于健康对照组（205±40）,P＜0.001,差异有统计学意义。Beta多样性中基于加权和未加权UniFrac距离绘制的PCoA散点图显示两组在菌种结构上有显著差异,P=0.001。3.规则完成全疗程患者与健康对照组人群的肠道微生物群对比,Chao1指数为抗结核治疗一周W组（124±62）、强化期治疗Q组（130±49）、治疗半年T组（181±63）、健康对照组H组（205±40）,四组比较,P＜0.001,表明同时比较四组,肠道菌群多样性有统计学差异。Beta多样性中基于加权和未加权UniFrac距离绘制的PCoA散点图显示两组在菌种结构上有显著差异,P=0.001。但在两组间相互对比时,W组和Q组无论在Alpha多样性分析（P=0.064）、Beta分析（Weighted UniFrac 距离 P=0.834;Unweighted UniFrac 距离 P=0.162）中,都没有明显的统计学差异,其他组别两两对比均有统计学差异。4.对于规则完成全疗程患者（n=18）,病灶吸收者17人,病灶吸收不明显者1人,其中病灶吸收小于50%有3人为TE1组,病灶吸收大于50%有14人为TE2组;Alpha多样性分析Chao1 指数TE1 组（160±62）、TE2组（173±60）,P=0.208,两组菌种多样性无统计学差异,Beta分析均提示P值大于0.05,肠道菌群组间结构没有差异,进一步完善Lefse分析,可见Dialister、fLachnospiraceae在病灶吸收大于50%的组中为优势菌群。结论在抗结核治疗各个时期,肠道微生物菌的菌种多样性均低于健康对照组,其菌种构成也是有差异的。早期抗结核治疗（包括抗结核治疗1周及强化期患者）,其菌种多样性变化不大,但早期治疗与抗结核治疗半年对比,其菌群多样性是有统计学差异的。通过分析,在抗结核治疗各个阶段与健康对照组对比,毛螺杆菌科、瘤胃球菌科、双歧杆菌科在治疗组中其相对丰度是下降的,Coprococcus、Anaerostipes、Roseburia、Ruminococcus、Akkermansia、Clostridium等产SCFA的细菌则在健康人群中富集,可能是区分健康人群与肺结核患者的一些生物标记物,而Dialister、fLachnospiraceae可能出现在病情明显好转,病灶明显吸收的患者中,其也可能作为治疗疗效评估的指标之一。