黄酮类化合物因其具有多种调节人体生理功能和治疗人类疾病的生理学功能而得到广泛的研究。目前黄酮类化合物的生产主要是通过植物提取和化学合成。然而,高成本的植物提取法和反应剧烈的化学合成法因其技术局限性限制了黄酮类化合物的大规模商业化生产。生物合成法因其具有成本低,反应条件温和等特点而成为黄酮类化合物合成的首选途径。本文以具有代表性的黄酮类化合物为研究对象,系统探索了生物合成法生产高附加值黄酮类化合物的可行性。挖掘、筛选不同来源的黄酮类化合物合成途径中的酶,对其反应条件进优化及研究其在黄酮类化合物生产中的特性;将玉米苯丙氨酸解氨酶(ZmPAL2)应用到反应分离耦合的催化体系,实现了肉桂酸的高效生产;通过分子改造技术提高了ZmPAL2的酪氨酸解氨酶活性,从而提高了p-香豆酸的产量;建立了能够高效合成柚皮素的体外多酶组合催化体系并对其条件进行优化,从而构建了柚皮素的无细胞体系合成途径;在谷氨酸棒杆菌中,利用分子手段对谷氨酸棒杆菌的启动子进行突变,获得具有不同强度启动子,并且在谷氨酸棒杆菌中成功构建出儿茶素的代谢途径。主要研究结果如下:(1)对不同来源的苯丙氨酸解氨酶(PAL)、4-香豆酰辅酶A连接酶(4CL)、查尔酮合成酶(CHS)和查尔酮异构酶(CHI)进行异源表达及反应条件的研究,筛选出具有较高酶活的玉米苯丙氨酸解氨酶(ZmPAL2)、大米4-香豆酰辅酶A连接酶(Os4CL)、矮牵牛查尔酮合成酶(MiCHS)和烟草查尔酮异构酶(NsCHI)。(2)利用ZmPAL2粗酶和含有ZmPAL2的重组菌进行肉桂酸的生物合成。在对反应条件优化后,ZmPAL2粗酶可以以10.0 g/L的苯丙氨酸为底物合成5.0g/L的反式肉桂酸;含有ZmPAL2的重组菌在反应分离耦合的体系中,可以以40.0g/L的苯丙氨酸为底物合成39.6 g/L的反式肉桂酸。(3)利用饱和突变对ZmPAL2进行理性改造,获得了酪氨酸酶活更高的F135H突变酶,并将其用于p-香豆酸的生物合成。对F135H突变酶的酶学性质研究表明,与天然酶相比,F135H突变对酶的最适pH、最适温度和pH稳定性没有影响,温度稳定性略有提高。与天然酶相比,突变酶通过粗酶和全细胞催化制备p-香豆酸的能力均有提高,产量分别提高了2.8倍和4.1倍。(4)利用筛选出的Os4CL、MiCHS和NsCHI体外多酶催化制备柚皮素。对多酶催化反应条件进行优化后,在优化后的条件下,多酶催化体系3 h内可以催化制备出32.0 mg/L的柚皮素。(5)筛选不同来源的儿茶素合成关键酶并进行组合优化,在谷氨酸棒杆菌中构建了儿茶素合成代谢途径。对谷氨酸棒杆菌的Tac启动子进行改造,构建含有不同强度的启动子库,证明合理选择不同强度的启动子可以提高黄酮类化合物的产量。本文基于黄酮类化合物体外多酶催化组合的研究,结合分子改造技术和对代谢途径中限制性因素的探究,实现了体外合成多种黄酮类化合物,为黄酮类天然产物合成中的进一步开发应用奠定基础。