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人细小病毒B19 (human paro virus B19),属于细小病毒科,细小病毒亚科,红细胞病毒属,最早于1975年被英国科学家Cossast发现并命名。是目前已知的对人类致病的细小病毒成员之一,另一个则是于2005年发现的人博卡病毒(human bocavirus)。B19病毒分布广泛,妇女和儿童是易感人群,自发现以来,与该病毒有关的疾病不断被报道,因感染个体的年龄和身体状况不同而表现为不同的症状,感染多发生在秋末、春季和夏初。儿童感染该病毒可引起传染性的红斑,又称“第五号疾病”；成人特别是成年妇女感染会引起短暂的关节痛；慢性贫血患者感染该病毒后可引起瞬时的再生障碍危象；免疫缺陷病人持续感染该病毒可能会引起慢性贫血,孕妇感染后,可导致胎儿水肿、死胎以及自然流产。最近的研究表明,心肌炎、肝炎和脊髓炎等疾病可能与该病毒的感染有关。B19病毒直径25nm,无包膜,病毒衣壳呈正二十面体结构,基因组为单链线性DNA,全长约5.6kb,基因组左端为非结构蛋白NS1的编码区,基因组右端为结构蛋白VP1 (84kDa)和VP2 (58kDa)的编码区,编码VP2的基因序列完全包含在VP1序列中,在VP1的N末端比VP2多227个氨基酸,称之为VP1独特区(uVP1)。研究发现大部分细小病毒的VP1独特区域都具有磷脂酶A2活性,细小病毒B19也具有这一特性。在病毒侵染宿主细胞的过程中,VP1独特区蛋白所具有的磷脂酶A2活性,使得病毒能够溶解宿主细胞膜,从而在病毒感染过程中发挥重要作用,目前该区域已经成为抗病毒药物设计的一个潜在靶标。本实验通过将uVP1的关键氨基酸进行定点突变,以期从磷脂酶A2活性以及病毒的感染性两方面研究VP1独特区的功能,研究的重点为独特区上对Ca2+结合起关键作用的130、132、134、154位氨基酸。在实验中,首先将目的基因VPlu插入到PUC-18a载体中,继而以构建的重组质粒PUC-uVP1作为模板,运用PCR快速突变法,得到不同位点突变后的克隆PUC-muVP1,经测序确认正确后,再将突变后的独特区插入到表达载体pMal-c2x中,构建重组原核表达载体pMal-umVP1。分别将不同位点突变后的原核表达载体在大肠杆菌中诱导表达,经SDS-PAGE和western-blot检测,再通过扩大培养诱导表达,并且过柱纯化,收集目的蛋白并检测其磷脂酶A2活性。本实验得到154突变后的uVP1,酶活检测显示,154突变后uVP1的酶活性完全丧失,这表明154位的天冬氨酸对于磷脂酶A2活性的维持必不可少。同时,构建相应位点突变后的B19全基因组感染性克隆,为在细胞水平研究uVP1的功能提供一个基本工具。在构建突变感染性克隆的过程中,将基因组上2251～4291bp的基因序列克隆到pBluescriptⅡKS (+)上,构建的重组质粒PB2040作为突变PCR的模板,用相应的突变引物通过体外快速突变法进行突变,筛选突变克隆并测序正确后,将突变以后的2040bp片段克隆到缺失2040bp片段的B19-4244质粒上,从而构建好相应的突变克隆B19-4244m。本实验已经成功构建了pB2040,并且通过PCR-SDM获得了132、134和154位氨基酸的突变体pBG132R、pBG134R, pBD154A,为突变感染性克隆的构建提供一个中间体。这些结果为进一步研究VP1独特区的功能提供了基本的分子生物学工具,为阐明B19病毒的感染机制提供了一定的理论基础。