产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）广泛存在于自然界和动物的肠道中,是一种重要的人兽共患传染病的病原体。该菌至少可产生16种外毒素,根据其产生的4种主要外毒素（?、?、?、?）,将产气荚膜梭菌分为A、B、C、D、E五个型。其中,ε毒素（epsilon toxin,ETX）主要是由B和D型产气荚膜梭菌产生的一种剧烈的致病因子,可导致山羊、绵羊和牛等动物的肠毒血症或坏死性肠炎,以及新生羔羊和犊牛腹泻等肠道致死性疾病。该病具有发病急、病程短、死亡快等特点,每年给我国乃至世界各国的畜牧业生产造成严重损失。因此,加强ETX的研究尤为必要。本实验室构建了一个具有良好保护作用的减毒突变体rETX^F199E,该突变体蛋白丧失了大部分的毒性,却仍然保留了较好的免疫原性。rETX^F199E可以保护免疫后的小鼠抵抗100×LD₅₀剂量ETX的攻击。但是该突变体的减毒机制尚不清楚,第199位苯丙氨酸在维持毒素活性方面所起的作用也不清楚,因此本课题设计了一系列的试验试图阐明第199位苯丙氨酸残基对维持ETX生物活性的作用。通过突变体蛋白的结构、毒性、细胞的结合活性及成孔活性等方面的研究分析ETX突变体蛋白的减毒机制,最终阐明ETX的关键氨基酸位点及其与生物活性、免疫原性的功能关系,为进一步研究ETX入侵目标细胞的分子作用机制和发展有效预防羊和牛等动物致死性肠道疾病的ETX突变体疫苗奠定了基础。首先,本研究以本实验室保存的pTIG-ETX和pTIG-ETX^F199E（C端带有6×His标签）质粒为模板,成功构建了pTIG-ETX和pTIG-ETX^F199E（N端带有6×His标签）重组表达载体,并对这四种蛋白进行了重组表达。对表达的蛋白使用Ni²⁺亲和柱进行亲和纯化。实验结果发现C端带有6×His标签的rETX^F199E和rETX蛋白可溶性表达量较高,而N端带有6×His标签的rETX^F199E和rETX蛋白可溶性表达量相对较低。N端和C端带有6×His标签的重组蛋白具有相似的生物活性（p>0.05）。将超滤浓缩后的蛋白用MTS法进行细胞毒性实验,用改良寇式法计算蛋白杀伤细胞的CT₅₀,结果显示rETX^F199E的CT₅₀约为99,581 ng/mL,rETX的CT₅₀约为180 ng/mL,突变体蛋白rETX^F199E的细胞毒性降低了553倍。接着,采用圆二色谱实验和热稳定实验测定ETX突变体蛋白的二、三级结构的变化情况。热稳定实验通过比较荧光曲线和T_m值来分析突变体蛋白构象的变化,按照说明书将蛋白和荧光染料按比例混合,用real-time PCR仪测定温度梯度25℃至95℃范围蛋白荧光信号,并自动绘制曲线,计算T_m值。结果显示rETX^F199E和rETX的T_m值分别为50.00±0.88°C、60.95±0.33°C,说明突变体蛋白的构象可能发生了变化。为了确定突变体蛋白的二级结构是否发生变化,又进行了圆二色谱实验。将稀释后的蛋白加入到1 mm的比色皿中,放入圆二色谱仪样品槽中测定185 nm²60 nm范围的光谱值（CD）。结果显示在200 nm²60 nm之间,rETX^F199E和rETX蛋白的紫外吸收情况没有太大的差别,在185 nm²00 nm之间,有较小的偏差。使用CDNN软件进行进一步分析rETX^F199E和rETX蛋白二级结构单元的组成差异,发现突变体蛋白和天然重组蛋白在α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲等二级结构单元的构成比上没有统计学差异（p>0.05）,说明两个蛋白的二级结构基本相同,F199位氨基酸突变对ETX的二级结构影响不大。其次,测定突变体蛋白与细胞的结合活性,选取对ETX敏感的MDCK细胞进行细胞结合实验,将不同浓度的突变体蛋白与MDCK细胞孵育后,用4%的多聚甲醛固定,5%的BSA封闭后与anti-His单克隆抗体孵育,然后与FITC标记的羊抗鼠二抗孵育。分别用多功能读板仪和激光共聚焦显微镜分析ETX突变体中的关键氨基酸位点对受体结合的影响。结果发现无论在低浓度还是高浓度下,rETX^F199E与靶细胞的结合程度要远远低于rETX与靶细胞的结合（p<0.05）,几乎不与MDCK细胞结合。这说明F199E突变影响了ETX与靶细胞的结合。利用激光共聚焦试验进一步验证突变体蛋白与细胞的结合活性,得出了相同的结果。随后对突变体蛋白在MDCK细胞上的七聚体形成能力进行检测,将突变体蛋白与MDCK细胞孵育后高温裂解细胞,用裂解后的细胞悬液进行Western-blot实验。结果发现rETX与MDCK细胞孵育后,在210 kDa左右观察到明显的条带,证明rETX在MDCK细胞膜上形成了七聚体。相比之下,突变体蛋白rETX^F199E与MDCK细胞孵育后在210 kDa左右几乎观察不到条带,说明rETX^F199E丧失了形成七聚体的能力。我们推测这是由于rETX^F199E第199位关键氨基酸突变后,影响了与MDCK细胞的结合能力,从而影响了在MDCK细胞膜上形成七聚体的能力。ETX是一种成孔毒素,可以在靶细胞膜上形成小孔,细胞外的钙离子可以通过小孔进入细胞,所以可以使用钙离子探针检测突变体蛋白的成孔能力。钙离子探针与MDCK细胞孵育后用PBS清洗,随后用含有CaCl₂的HBSS缓冲液将突变体蛋白稀释到不同浓度,将稀释好的溶液与MDCK细胞孵育,在多功能读板仪中连续读取荧光值,以荧光值的变化来反应突变体蛋白的成孔能力。结果发现rETX与MDCK细胞孵育后,随着孵育时间的延长,荧光信号逐渐增强,表明细胞内Ca²⁺的增加,从而说明rETX可以在MDCK细胞膜上成孔。而rETX^F199E与MDCK细胞孵育后,随着孵育时间的延长,荧光信号无明显波动,表明rETX^F199E不能在细胞表面有效成孔。我们推测rETX^F199E第199位关键氨基酸突变后,影响了与MDCK细胞的结合能力,从而影响了在MDCK细胞膜上形成七聚体和成孔能力,造成突变体蛋白毒性减弱。此外,还发现当细胞外无Ca²⁺时,rETX也能使细胞内Ca²⁺浓度增加,表明ETX毒素能促进细胞内的钙池释放Ca²⁺,这可能是ETX毒素发挥细胞毒的另一种途径。最后,利用扫描电镜观察突变体蛋白对MDCK细胞造成的形态学变化,将不同浓度的突变体蛋白与MDCK细胞孵育后,将细胞用2.5%戊二醛固定,梯度浓度的乙醇水溶液脱水,然后将样本冷冻干燥、镀金,进行扫描电镜观察。结果观察到MDCK细胞与ETX毒素孵育后,形状由饱满的圆形变为皱缩和凹陷,而MDCK细胞与突变体蛋白孵育后,形态未发生明显变化。这些形态学的差异也说明F199E氨基酸突变对ETX的毒性产生了极大的影响。通过以上的研究我们证明了F199E突变通过降低ETX与靶细胞的结合能力来降低ETX毒性,然而由于ETX毒素在靶细胞上的受体分子一直未得到确定,导致目前很多问题不能解决,例如毒素分子与靶细胞上受体的结合位点尚不清楚。突变体rETX^F199E丧失了受体结合活性,因此可以作为受体研究的一个平台。受体的确定对毒素分子结构和功能以及信号通路的研究具有重要意义,更能促进毒素中毒治疗方法的研究和开发。因此进一步对ETX毒素受体的鉴定十分重要。进行ETX受体的研究首先要分离到MDCK细胞表面可以和ETX结合的蛋白质,然后对其进行分析和鉴定。受体的分离采用免疫共沉淀方法和亲和层析技术,然后采用质谱技术进行鉴定。将rETX和rETX^F199E与MDCK细胞孵育,然后加入TritonX-100将两组细胞裂解。裂解产物分别通过Ni²⁺亲和柱,然后利用洗脱缓冲液将结合的蛋白洗脱下来,采用同位素标记相对与绝对定量技术（isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ）对两组蛋白进行差异性分析。实验结果显示,差异性较大的蛋白有CKAP₄（cytoskeleton-associated protein 4）、ERGIC-53、A₂MRAP（alpha-2-macroglobulin receptor-associated protein）、Annexin A₂,它们都位于MDCK细胞膜上,最有可能为ETX的受体。至于4种蛋白是否与ETX相互作用,是否为ETX的受体,还要进一步采用一系列包括体内、体外试验来进行验证。本研究阐明了突变体F199E的减毒机制,证明了199位氨基酸突变通过抑制受体结合来降低产气荚膜梭菌ε毒素的毒性,推测F199E突变体影响了ETX毒素与靶细胞的结合继而影响了成孔和七聚体的形成。我们还发现ETX毒素能促进细胞内的钙池释放Ca²⁺,这可能是ETX毒素发挥细胞毒作用的另一种途径。这些发现同时也说明了rETX^F199E作为候选疫苗的安全性,辅助证明了突变体蛋白rETX^F199E可以作为人或动物的候选疫苗。这些发现对ETX的致病机制和突变体蛋白疫苗的研究具有重要意义。