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以我国重要的冷水性经济养殖鱼类大菱鲆(Scophthalmus maximus L.)为研究对象,在室内循环养殖水系统进行摄食生长实验,以探究饲料中脂肪水平和脂肪酸组成对大菱鲆生长、脂肪酸组成、脂肪沉积及其相关基因表达的影响,在此基础上探讨大菱鲆摄食高脂或高植物油水平饲料后肝脏脂肪过多沉积的分子机制。本文的研究内容和主要研究结果如下: 1.大菱鲆脂蛋白脂酶、过氧化物酶体增殖物激活受体α和微粒体甘油三酯转移蛋白的克隆、表征分析和组织差异性表达 通过同源克隆和RACE技术从大菱鲆中获得脂蛋白脂酶(LPL)、过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)和微粒体甘油三酯转移蛋白(MTP)的cDNA全长。大菱鲆LPL全长共计2074bp,其中5′-非编码区、3′-非编码区和开放阅读框(ORF)分别为152bp、377bp和1545bp,编码514个氨基酸。LPL具有1个跨膜区域。通过氨基酸序列比对发现,大菱鲆 LPL与其它已知鱼纲脊椎动物该基因序列具有高度同源性。组织差异性表达结果显示,大菱鲆 LPL在肌肉中表达量最高,其次是肝脏和肾脏,而在鳃、脑、脾脏、心脏、肾脏、精巢、小肠和幽门盲囊中表达量较低(P<0.01)。大菱鲆PPARα全长共计2992bp,其中5′-非编码区、3′-非编码区和ORF分别为397bp、1170bp和1425bp,共编码474aa。大菱鲆PPARα具有1个跨膜区域,与其它已知鱼纲脊椎动物该基因序列具有高度同源性。PPARα在肝脏中表达量最高,其次是在肌肉、心脏、肾脏和脑,而在鳃、幽门盲囊、精巢、小肠和脾脏中表达量较低(P<0.01)。大菱鲆MTP全长共计3309bp,其中5′-非编码区、3′-非编码区和ORF分别为91bp、551bp和2667bp,编码888个氨基酸。通过氨基酸序列比对发现,大菱鲆MTP与其它已知鱼纲脊椎动物该基因序列具有高度同源性。MTP在大菱鲆幽门盲囊中表达量最高,其次是肌肉、小肠、肝脏和肾脏,而在脑、鳃、精巢、心脏和脾脏中表达量较低(P<0.01)。 2饲料脂肪水平对大菱鲆幼鱼生长、血浆生化指标、脂肪酸组成、脂肪沉积及相关基因表达的影响 大菱鲆已养殖多年,但有关大菱鲆饲料最适脂肪水平研究并未见报。故以鱼油/豆油(1:1)为主要脂肪源,配制脂肪含量为3.41％、8.01%、11.87%、15.73%、19.34%和22.68%的6种等氮(粗蛋白为51%)等无氮溢出物(13.05%)饲料以探究饲料脂肪水平对大菱鲆(初始体重为9.49±0.03g)生长、脂肪酸组成,血浆生化指标、脂肪沉积及相关基因表达的影响。每组饲料随机投喂三组实验鱼,饱食投喂,养殖周期为12周。实验结果表明,大菱鲆存活率(SR)随饲料脂肪水平的升高先显著升高后趋于平稳。饲料脂肪水平≤8.01%(L3.41组和 L8.01组)组大菱鲆SR显著低于脂肪水平≥11.87%组(L11.87组、L15.73组、L19.34组和L22.68组)(P<0.05)。随饲料脂肪水平升高,大菱鲆幼鱼增重率(WGR)和特定生长率(SGR)先显著升高(P<0.05)后趋于平稳;饲料效率(FE)和蛋白质表观利用率(ANPU)均先显著升高后显著下降(P<0.05)。饲料脂肪水平并未显著影响鱼体肝体比和脏体比,但显著影响肝脏和肌肉脂肪含量,且后者与饲料脂肪含量呈正相关(P<0.05)。肝脏和肌肉脂肪酸组成基本反映了饲料脂肪酸组成。大菱鲆血浆甘油三酯含量、胆固醇、高密度脂蛋白-胆固醇(HDL-c)和低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-c)与饲料脂肪水平呈正相关。L8.01组 HDL-胆固醇/LDL-胆固醇(HDL-c/LDL-c)显著高于 L3.41组、L19.34组和 L22.68组(P<0.05),与L11.87和L15.73组差异不显著。肝脏脂蛋白脂酶(LPL)和苹果酸酶(ME)活力随饲料脂肪水平上升先显著下降(P<0.05),随后升高,且均在L8.01组达到最小值。对肝脏脂肪代谢关键基因实时荧光定量PCR分析结果表明:LPL、肉碱棕榈酰转移酶-Ⅰ(CPTⅠ)和过氧化物酶体增殖活化受体γ共激活因子-1α(PGC1α)相对表达量均随饲料脂肪水平升高先显著下降,随后升高后又下降,且最大值均在L3.41组(P<0.05)。过氧化物酶体增殖活化受体α(PPARα)和磷脂酸磷酸化酶1(Lipin1)基因相对表达量在脂肪水平≤15.73%各组组间差异不显著(P>0.05);且其随饲料脂肪水平进一步升高而先显著升高(P<0.05)后缓慢下降,L19.34组Lipin1基因相对表达量显著高于L11.87组,与其他各组差异不显著。脂肪酸合成酶(FAS)随饲料脂肪水平升高先显著下降后趋于平稳,而PPARγ和肝X受体(LXR)随饲料脂肪水平升高先升高后显著下降,随后再次升高又下降。在转录水平上,饲料脂肪水平并未显著影响AMP活化蛋白激酶(AMPK)、去乙酰酶1(SIRT1)、固醇调节元件结合蛋白(SREBP-1)和脂肪转运相关基因(载脂蛋白B-100、微粒体甘油三酯转移蛋白和肝细胞核因子4α)相对表达量(P>0.05)。综上可知:1)在饲料粗蛋白为50%干重时,脂肪水平在9.378%-15.73%干重均具有较好的生长、饲料利用和生理状态,脂肪水平过高或过低均会降低以上指标;2)过低或过高饲料脂肪水平均一定程度上促进了肝脏脂肪分解相关基因表达;3)高脂造成大菱鲆肝脏脂肪沉积可能与脂肪合成上调有关;4)大菱鲆肝脏可能存在 AMPK—SIRT1—PGC1-α—Lipin1—PPARα脂肪分解调节途径。 3棕榈油、菜籽油、豆油和亚麻籽油替代鱼油不同水平对大菱鲆幼鱼生长和脂肪酸组成的影响 水产养殖业可持续发展与鱼粉鱼油资源有限性的矛盾日益激化,大菱鲆作为我国重要海水养殖鱼类,其替代脂肪源的研究势在必行。故以棕榈油(PO)、菜籽油(RO)、豆油(SO)和亚麻籽油(LO)分别替代鱼油0%、33.3%、66.7%和100%四个水平,配制13种等氮等脂饲料以探究植物油替代不同水平的鱼油对大菱鲆幼鱼(初重为5.89±0.02g)生长、脂肪酸组成以及肝脏和肌肉脂肪沉积的影响。每组饲料随机投喂三组实验鱼,饱食投喂,养殖周期92-d。实验结果表明,PO、RO、SO和LO替代鱼油不同水平并未显著影响大菱鲆幼鱼存活率(SR)。随饲料PO水平升高,大菱鲆幼鱼末重(Wt)、特定生长率(SGR)和饲料效率(FE)均随之先升高后显著下降(P<0.05)。随饲料RO或SO水平升高,大菱鲆幼鱼 Wt和SGR均随之而显著下降。饲料RO水平并未显著影响大菱鲆幼鱼FE和蛋白质表观净利用率(ANPU)(P>0.05)。33.3%SO组和100%SO组FE显著低于FO组(P<0.05),与66.7%SO组组间差异不显著(P>0.05)。饲料LO水平并未显著影响鱼体Wt和SGR。100%LO组FE和ANPU均显著低于其他LO组(P<0.05)。饲料植物油水平并未显著影响大菱鲆幼鱼鱼体体成分(P>0.05)。肝体比(HSI)随饲料RO水平升高而显著升高(P<0.05)。饲料PO、RO和LO水平均未显著影响大菱鲆肌肉脂肪含量(P>0.05),但33.3%SO组肌肉脂肪含量显著低于其他 SO的三组(P<0.05)。随饲料植物油水平升高,大菱鲆肝脏脂肪含量显著升高(P<0.05)。饲料RO、SO和LO水平并未显著影响大菱鲆幼鱼饲料脂肪表观消化率(ADC)(P>0.05),随饲料PO水平升高,大菱鲆幼鱼饲料脂肪ADC随之先升高后显著下降(P<0.05)。肝脏和肌肉脂肪酸组成与饲料脂肪酸组成相似,随着VO替代水平升高,肝脏和肌肉中植物油相对应富含脂肪酸含量增多,且鱼油富含脂肪酸如(EPA和DHA)含量随之显著下降。综上可知:PO、RO、SO和LO替代66.7%鱼油均未显著影响大菱鲆生长和饲料利用,但大菱鲆肝脏脂肪含量显著升高,且肌肉中EPA和DHA含量显著下降,故从营养品质角度建议大菱鲆饲料中植物油水平应低于66.7%,且大菱鲆饲料中必需脂肪酸含量应大于0.8%。 4满足n3 LC-PUFA需求下,饲料脂肪酸组成对大菱鲆生长、血浆生化指标、脂肪酸组成、脂肪沉积及相关基因表达的影响 前期实验研究发现植物油替代鱼油(FO)促进大菱鲆肝脏脂肪过多沉积和肌肉n3长链多不饱和脂肪酸(n3 LC-PUFA)含量下降,故本实验旨在满足n3 LC-PUFA需求下,以棕榈油(PO)、菜籽油(RO)、豆油(SO)和亚麻籽油(LO)替代同一水平FO配制5种等氮等脂饲料,探究植物油对大菱鲆幼鱼(初始体重为9.49±0.03g)生长、血浆生化指标、脂肪酸组成、脂肪沉积及相关基因表达的影响。每组饲料随机投喂三组实验鱼,饱食投喂,养殖周期为12周。实验结果表明,在满足n3 LC-PUFA需求下,PO、RO、SO和LO替代66.7%FO并未显著影响大菱鲆幼鱼存活率、特定生长率、饲料效率、蛋白质表观净利用率、肝体比和脏体比(P>0.05)。肝脏和肌肉脂肪酸组成组间差异显著,与饲料脂肪酸组成相似。RO组血浆甘油三酯最低,高密度脂蛋白-胆固醇/低密度脂蛋白胆固醇(HDL-c/LDL-c)比例最高。RO组、SO组和LO组大菱鲆肝脏脂肪含量均显著低于PO组和FO组(P<0.05),肝脏葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)和苹果酸酶(ME)活力具有相反的趋势。RO组和LO组的肝脏脂蛋白脂酶(LPL)、肝X受体(LXR)和载脂蛋白 B-100或 LO组微粒体甘油三酯转移蛋白(MTP)或SO组过氧化物酶体增殖物活化受体α(PPARα)基因相对表达量均显著高于FO组(P<0.05),但RO组、SO组和LO组大菱鲆肝脏PPARα和脂肪酸合成酶(FAS)表达量均显著低于PO组(P<0.05)。综上可知:1)在满足n3 LC-PUFA需求下, PO、RO、SO和LO替代66.7%鱼油并未显著影响大菱鲆生长和饲料利用;2)在满足n3 LC-PUFA需求下,饲料相对高MUFA(RO)水平将更有利于大菱鲆的心血管健康;3)摄食RO、SO和LO饲料的大菱鲆肝脏脂肪过多沉积可能是通过上调脂肪合成基因表达。