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量子点作为一种新型的纳米荧光材料,具有许多传统的有机荧光染料所无法比拟的优异光学性质。不同粒径的量子点可以用单一波长的光激发出不同的颜色,发射光谱也不易重叠;且光稳定性好,抗光漂白能力强。这种独特的光学性质,使得量子点近年来在活细胞标记、在体组织成像、大分子蛋白检测、纳米生物传感等方面已取得很多有意义的成果,在生命科学领域显示出广阔的应用前景。本论文主要工作是研究了壳核型量子点作为荧光探针的光学性质及生物偶联等特性,重点研究了其在细胞生物学领域的应用。论文完成的具体工作如下:
(1)通过量子点CdSe/ZnS和CdTe共价结合转铁蛋白(transferrin,Tf)及变性转铁蛋白(denatured transferrin,dTf)制备了CdSe/ZnS-dTf、CdTe-dTf、CdSe/ZnS-Tf及CdTe-Tf四种荧光探针。借助毛细管电泳和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对偶联物进行了表征,证实了偶联的有效性,并获取了最佳比率。通过长时间孵育标记HeLa细胞,比较了四种荧光探针和原始量子点CdSe/ZnS、CdTe的细胞毒性。结果显示:CdSe/ZnS-dTf探针细胞毒性最小,这种探针制备方法简单,与原始量子点相比,量子产率提高了7%,从而为开发新型低毒性量子点探针提供了一种新的思路。
(2)利用量子点标记的转铁蛋白探针,观察了不同浓度的铁离子对转铁蛋白细胞内吞过程的影响。结果显示正常生理状态、高铁状态和缺铁状态下,细胞荧光都经历了从暗到亮再到暗的过程。与正常状态相比,高铁状态下细胞的荧光衰减明显,而缺铁状态下,在整个观察时段都显示出较强的荧光。光强度分析结果显示,三种状态下,细胞荧光增强到一定程度都有一个平台期,随后细胞荧光强度变化明显不同。通过光谱仪比较三种状态下相同时间点的荧光峰值也发现,缺铁状态下的荧光强度几乎是正常状态下的2倍,证明了高铁和缺铁状态对转铁蛋白的细胞内吞过程的不同影响。这种方法简单直观,为研究铁与转铁蛋白及细胞的关系提供了新的手段。
(3)研究了水相合成的以巯基丁二酸为稳定剂的壳核型的CdTe/CdS量子点的光学性质,发现包壳后的CdTe/CdS量子点与包壳前相比的荧光稳定性好,这种壳核型的量子点可用做生物荧光探针,能有效的和变性转铁蛋白连接,并通过和细胞表面的转铁蛋白受体作用实现对HepG2(人肝癌细胞)的标记成像。
(4)通过将巯基乙胺和巯基乙酸简单配比后修饰CdSe/ZnS量子点,得到表面带有不同电荷的水溶性的CdSe/ZnS量子点,这种量子点能和质粒DNA通过静电作用结合在一起,并且这种复合物能抗DNA酶的降解作用,且带不同的电荷的量子点转染效率不同。监测转染过程发现,在转染最初的6 h内,CdSe/ZnS-DNA复合物经历了结合细胞膜、穿透细胞膜进入细胞的过程,18 h后细胞内开始了质粒DNA的表达,EGFP的绿色荧光开始出现,其后的6 h内完全表达。毒性实验结果显示这种复合物的毒性比商业化的脂质体转染试剂小。