DNA甲基化现象广泛存在于真核生物中,并且在真核生物调控基因表达的过程中扮演着极为重要的角色。植物DNA甲基化状态的改变受到多种因素的影响,温度、盐分、旱涝、光照条件等的改变甚至病虫害均会导致植物DNA甲基化情况发生相应的变化。本实验采用甲基化敏感扩增多态性(methylation sensitive amplification polymorphism, MSAP)技术,对种植在云南大理州的南涧、云龙、巍山、宾州和弥渡五个不同地域的烟草红花大金元品种(Nicotiana tobacum L.cv.var. Honghuadajinyuan)营养生长阶段和生殖生长阶段的样品进行了DNA甲基化状态分析,并对具有显著DNA甲基化差异的片段克隆测序,以分析不同地理环境条件多种环境因子对红花大金元品种烟草甲基化差异造成的影响。通过采用10对不同的MSAP选扩引物,得到了如下结果：(1)对五个不同阶段,五个不同地区的两个样品(同一植株上的第四片叶和第十片叶)进行选择性扩增,共得到了424个位点。所获得的条带分为三种类型,第一类：非甲基化条带(E-H/E-M,+/+),第二类：半甲基化条带(E-H/E-M,+/-)及第三类：全甲基化条带(E-H/E-M,-/+)。三种条带类型中,非甲基化条带所占比例最大(27.59%-58.25%),其次依次为全甲基化条带(19.34-42.45%)和半甲基化条带(3.54%-14.86%)。(2)对红花大金元植株营养生长阶段内不同地区样品进行的数据分析结果表明,营养生长阶段内不同采样地的样品具有显著地域分布特征：南涧与云龙两地的样品在该阶段甲基化模式较接近,因此两地样品在PCA坐标图上相互距离较近,在UPGMA中也聚为一个分支；巍山、弥渡、宾川三地的样品甲基化模式比较接近,因此三地样品在PCA坐标图上相互距离比较接近,其样品在UPGMA图上聚为另一支。以上结果表明,在营养生长阶段,地理环境因素确实对烟草植株的甲基化情况造成了影响,且结果可信度较高。(3)对烟草植株进入生殖生长以后阶段的不同地区样品的分析表明,该阶段样品除少部分地区样品外,大多数样品的甲基化模式在PCA坐标图上呈现出分散分布的趋势,甲基化差异从营养生长阶段过渡到生殖生长阶段和衰老阶段呈现扩大趋势,对这个阶段样品进行的UPGMA聚类分析也反映出类似结果。对该时期样品同时进行PCA和UPGMA分析均得到相同结论,表明该结果可信度较高。试验表明,在生殖生长和衰老阶段,地理环境差异、发育阶段差异、以及长期的甲基化变化积累作用,都可能是造成该发育阶段各地区样品甲基化差异大的原因。(4)在本试验中,营养生长阶段的烟叶表现出地域性的甲基化差异,而进入生殖生长阶段后,在地域因素及发育巨变等多种因素共同作用下导致各地的烟草叶片甲基化差异达到峰值。多种因素导致的甲基化差异的不断累积,以及不同地域环境下不同内生菌参与的物质代谢过程的共同作用,或是最终造成不同产地烟叶具有不同化学成分比例和评吸风格的生物学机制。(5)将通过MSAP处理后的部分具有明显多态性的片段进行克隆测序及序列比对分析后发现,获得的条带序列大多与烟草的甲基化敏感相关位点基因高度同源,其中不乏有温度、金属离子胁迫、病害等环境因素所引起的烟草基因甲基化反应相关的序列；还有一部分序列与植物的细胞器相关,如与叶绿体、线粒体等。这些结果证实了试验前进行的假设：通过一些环境刺激的作用,不同的地域环境确实对烟草甲基化状态产生了影响,同时不同发育阶段也与烟草甲基化状态密切相关。相信这些试验数据可为后续相关研究工作提供一些有价值的参考与帮助。