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鸡致病性大肠埃希菌（Escherichia coli）是引起鸡感染的重要病原菌之一，对养鸡业危害严重。针对大肠埃希菌耐药严峻的状况，加强大肠埃希菌耐药性研究具有重要意义。本研究以鸡源致病性大肠埃希菌徐州分离株为研究对象，检测其耐药表型和耐药基因，在构建耐药基因重组菌的基础上探讨了耐药表型与耐药基因间的相关性，从而为临床用药提供理论支持，为寻找药物作用靶点，研发新型抗菌药物奠定基础。主要研究内容包括： 1.鸡致病性大肠埃希菌的分离鉴定 从4批疑似患大肠杆菌病病鸡体内分离鉴定致病性大肠埃希菌，作为后续试验菌株。采用常规细菌分离培养方法结合人工感染试验从病鸡肝脏分离获得2株致病菌，分别命名为CE和SE菌株。根据其染色特性、菌落特征和生化特性进行初步鉴定；然后进行16S rDNA基因PCR扩增和序列分析。结果显示，2株分离菌为G-短杆菌，散在排列；在伊红-美蓝（EMB）培养基上生长出典型的具有金属光泽的墨绿色菌落；生化特性符合《伯杰氏细菌鉴定手册》中大肠埃希菌属(Escherichia sp.)细菌的特性。分离菌株16S rDNA基因大小分别为1502 bp和1503 bp，与大肠埃希菌标准株（ATCC11775T，ATCC8739T）的相似性介于98.7％-99.8%之间，CE菌株与标准株ATCC11775T自然聚为一支，而SE菌株与标准株ATCC8739T自然聚为一支。结果表明，CE和SE菌株均为致病性大肠埃希菌。 2.鸡致病性大肠埃希菌耐药性研究 分别采用K-B纸片扩散法和PCR方法检测分离菌株的耐药表型及其携带耐药基因，结果显示2个分离株均对6类（β-内酰胺类、氨基糖苷类、大环内酯类、四环素类、喹诺酮类和磺胺类）中16种抗菌药物呈现多重耐药，并且携带相应的耐药基因（Bla-TEM、Aac(3)、TetA）以及多重耐药基因AcrA。生物信息学分析表明所测上述耐药基因高度保守，与大肠埃希菌参考株的相应耐药基因的相似性介于99.0%-100.0%之间。氨基酸序列分析可见，Bla-TEM基因编码分子量约为31.5kDa的β-内酰胺酶；Aac(3)编码分子量约为30.7kDa的氨基糖苷类3-N-乙酰基转移酶Antibiotic_NAT；AcrA基因编码分子量约为42.4kDa的多重耐药蛋白mdtA；TetA基因编码分子量约为45.2kDa的四环素外排泵蛋白mdtl。 3.耐药基因重组菌的构建与表达 应用基因重组技术构建耐药基因重组质粒PET-28a-Bla-TEM、PET-28a-Aac(3)和P ET-28a-TetA，转化至工程菌BL21(DE3)中，经双酶切和PCR鉴定获得3株含有耐药基因的重组工程菌PET-28a-Bla-TEM/BL21、PET-28a-Aac(3)/BL21和PET-28a-TetA/B L21。重组工程菌经1mmol/L IPTG诱导6h后，可表达分子量分别为31.5kDa、30.7kDa和45.2kDa的Bla-TEM蛋白、Aac(3)蛋白和TetA蛋白。 4.耐药基因与耐药表型相关性分析 为了解耐药基因与细菌耐药性的相关性，本研究以对β-内酰胺类、氨基糖苷类和四环素类抗菌药物敏感的工程菌BL21(DE3)为出发菌，构建耐药基因重组菌。通过测定重组前后细菌的耐药表型变化和抗生素对细菌生长的影响，分析耐药表型与耐药基因间是否存在相关性。结果显示Bla-TEM重组菌对β-内酰胺类抗生素的耐药性增强，具体表现为对哌拉西林的敏感性由敏感转为耐药，对氨苄青霉素、阿莫西林、头孢哌酮、头孢克肟和头孢噻肟的敏感性均由敏感转变为中敏；Aac(3)重组菌对丁胺卡那霉素、庆大霉素和乙基西梭霉素的敏感性均由敏感转变为耐药；TetA重组菌对四环素类药物的敏感性未发生改变。氨苄青霉素对Bla-TEM重组菌生长无明显影响，重组菌在未添加和添加氨苄青霉素培养液中培养8h，OD600nm值分别为1.875与1.865；卡那霉素对Aac(3)重组菌生长具有低水平抑制作用，在未添加和添加卡那霉素的培养液中培养8h，OD600nm值分别为1.879和1.475；而四环素明显抑制TetA重组菌生长，在未添加和添加四环素的培养液中培养至8h时，OD600nm值分别为1.845与0.524，结果表明，耐药基因与耐药表型存在一定的相关性。 综上所述，本研究证实鸡致病性大肠埃希菌耐药严重，耐药基因与耐药表型间存在一定的相关性。研究结果可为临床用药提供理论依据，也为寻找药物作用靶点，研发新型抗菌药物奠定了基础。