【摘 要】
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目的目前,临床上对缺血性脑卒中采用静脉注射组织纤溶酶原激活剂（recombinant tissue plasminogen activator,rt-PA）溶栓和机械取栓的治疗方法,但两种疗法均受有限时间窗的限制及引起缺血再灌注损伤。外泌体具有纳米尺寸的囊泡结构,通过运输亲本细胞的生物活性物质到受体细胞,调控细胞生物学行为及其功能。研究发现外泌体对脑缺血再灌注损伤具有一定的神经保护作用,而低氧微环
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目的目前,临床上对缺血性脑卒中采用静脉注射组织纤溶酶原激活剂（recombinant tissue plasminogen activator,rt-PA）溶栓和机械取栓的治疗方法,但两种疗法均受有限时间窗的限制及引起缺血再灌注损伤。外泌体具有纳米尺寸的囊泡结构,通过运输亲本细胞的生物活性物质到受体细胞,调控细胞生物学行为及其功能。研究发现外泌体对脑缺血再灌注损伤具有一定的神经保护作用,而低氧微环境会影响细胞生物行为及其功能,并改变所释放外泌体内含物成分而具有特殊的治疗效果。本课题通过制备低氧微环境预处理大鼠骨髓间充质干细胞来源外泌体,探索其在缺糖缺氧/再灌注损伤星形胶质细胞中的作用。方法1.培养大鼠骨髓间充质干细胞,利用流式细胞术检测其表面标志物蛋白（CD105、CD90、CD44、CD34）表达情况以进行细胞纯度鉴定;低氧微环境预处理骨髓间充质干细胞并获得培养上清液,利用超速离心法分别获得正常氧浓度培养来源外泌体和低氧诱导来源外泌体。2.透射电子显微镜技术观察不同培养来源外泌体形貌及颗粒大小,纳米颗粒示踪技术检测外泌体粒径分布及浓度,Western blot技术检测外泌体标志物蛋白表达情况,real-time PCR技术检测不同微环境来源外泌体中miR-21富集水平。3.培养原代大鼠星形胶质细胞,并进行荧光标记鉴定;建立星形胶质细胞缺糖缺氧/再灌注（oxygen-glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R）损伤模型;正常氧浓度及低氧诱导来源外泌体孵育缺糖缺氧/再灌注损伤大鼠星形胶质细胞;CCK-8试剂盒检测细胞活力变化,real-time PCR技术检测细胞炎症因子mRNA表达情况,TUNEL试剂盒标记检测细胞凋亡比例,Western blot方法检测细胞凋亡相关分子表达情况。结果1.培养大鼠骨髓间充质干细胞均表达CD105、CD90蛋白,而不表达CD44、CD34蛋白说明本课题分离培养的大鼠骨髓间充质干细胞纯度较高;大鼠骨髓间充质干细胞在低氧处理后增殖能力要高于正常氧浓度组,且48 h最明显。2.正常氧浓度来源外泌体与低氧诱导来源外泌体,均具有圆形或椭圆形的形貌特征,表达外泌体标志物蛋白CD9、CD63和HSP90,绝大多数粒径在50～150 nm范围内。与正常氧浓度来源外泌体相比,低氧诱导来源外泌体中miR-21得到明显富集。3.原代培养的星形胶质细胞纯度较高,均表达星形胶质细胞标志物蛋白GFAP。低氧诱导来源外泌体可有效提高缺糖缺氧/再灌注损伤后星形胶质细胞中miR-21水平。低氧诱导来源外泌体可有效提高缺糖缺氧/再灌注损伤后细胞活力,改善缺糖缺氧/再灌注损伤后星形胶质细胞免疫炎症,并抑制细胞凋亡的发生。结论低氧诱导来源外泌体可以有效补充星形胶质细胞中miR-21含量,保护缺糖缺氧/再灌注损伤诱导的星形胶质细胞损伤,其机制可能抑制星形胶质细胞介导炎症反应和减少星形胶质细胞凋亡有关。本课题的实施可为间充质干细胞来源外泌体应用于脑缺血/再灌注损伤的治疗提供新的实验依据和理论基础。
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