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志贺菌病是由革兰氏阴性志贺菌引起的,可出现伴有血液和粘液的稀粪便,同时会引起机体的里急后重、腹部疼痛和发热等发病症状。志贺菌除感染人外,还可以感染猪、猕猴、狐狸、牛、鸡、鸭等多种动物。近些年发现的鸡源志贺菌可感染不同品种和日龄的鸡,尤其是雏鸡,给养禽业带来严重的影响。国内外研究发现鸡源志贺菌不仅可引起家禽的相互感染,在人禽之间也会发生交叉感染,不仅给养禽业的发展带来损害,也给人类的卫生安全造成了隐患。志贺菌引起机体发病的关键环节是能侵入肠上皮细胞内进行增殖和扩散,而这一环节的发生又必须具备两个要素,一是肠上皮细胞表面必须存在细菌吸附所需的相应特异性受体,该受体已被证实存在于人肠道上皮细胞的基底外侧膜;二是志贺菌必须具有与细胞表面受体相结合的侵袭性蛋白。主要包括编码Ⅲ型分泌系统的mxi-spa基因和编码侵袭性蛋白Ipa(A、B、C、D)的基因。侵袭性蛋白Ipa B和IpaC结合成复合物,复合物的IpaC端首先与肠上皮细胞基底面的受体结合,并进一步介导细菌侵入细胞。体外实验表明,只有重组纯化的IpaC蛋白才能够在一定程度上恢复志贺菌的侵袭能力。相关研究表明:人源志贺菌可感染雏鸡并引起发病死亡,而且还发现鸡源志贺菌拥有与人源菌株相同的IpaC蛋白分子,但是尚不清楚鸡源志贺菌是否存在与人相似的IpaC蛋白受体分子。本研究进行鸡肠上皮细胞膜上IpaC蛋白受体的筛选,为进一步阐明志贺菌在鸡体内的致病机制奠定了基础、提供了科学依据。研究结果如下:1.鸡源志贺菌IpaC基因的原核表达及IpaC蛋白纯化利用本实验室构建和保存的重组表达菌株pET32a-IpaC/BL21和p ET32a/BL21,进行菌种复苏和培养,并进行PCR鉴定。37℃培养至OD600为0.6-1.0时,加入终浓度为1.0m M的IPTG诱导剂诱导,28℃继续培养8h。利用超声波破碎仪裂解菌液,破碎上清用镍柱亲和纯化,纯化条件为:含咪唑50mM的Washing Buffer洗脱杂蛋白,含咪唑250mM的Elution Buffer洗脱目的蛋白。表达和纯化后的蛋白利用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定,SDS-PAGE结果表明不但成功表达出了IpaC蛋白和空载体蛋白,并且两种蛋白的纯化结果都达到95%以上,Western blot结果表明IpaC蛋白和空载体蛋白具有良好的生物学活性。2.鸡肠上皮细胞的培养及膜蛋白的提取采用18日龄的SPF鸡胚进行肠组织的分离,利用300U/mL XI型胶原酶和0.1 mg/mL I型中性蛋白酶进行联合消化肠组织,用贴壁时间差法纯化鸡肠上皮细胞,在倒置显微镜下能看到呈铺路石样的细胞,碱性磷酸酶染色为阳性。利用膜蛋白提取试剂盒提取培养48h的肠上皮细胞的膜蛋白,并用Na+/K+-ATPaseα1兔源多克隆抗体进行Western blot鉴定,结果表明提取物中富集了鸡肠上皮细胞膜蛋白。3.鸡源志贺菌IpaC蛋白受体的筛选利用生物素标记试剂盒标记IpaC蛋白和空载体蛋白,由于生物素和亲和素系统具有较强结合能力,利用链霉亲和素磁珠和生物素标记的IpaC蛋白进行磁性分离,能与IpaC蛋白结合的鸡肠上皮细胞膜蛋白会被富集到磁珠上,加入蛋白上样缓冲液分离磁珠和富集物。处理好的磁珠样品进行SDS-PAGE分离和Western blot鉴定,确定能和IpaC结合的目的条带。筛选出的蛋白条带利用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)进行质谱检测和生物信息学分析,结合对IpaC蛋白已有资料的分析,初步将annexin A2,37kD Laminin receptor precursor,LIM and SH3 protein 1,ras-related protein Rab-43作为IpaC蛋白受体的候选蛋白,并明确了其氨基酸序列,关于确切的IpaC受体试验目前正在进行中,有关该受体的蛋白结构和生物学功能有待进一步研究。