恶性胸腔积液(malignant pleural effusion,MPE)是指由肺癌或其他部位恶性肿瘤累及胸膜或胸膜原发肿瘤所致的胸腔积液,是晚期恶性肿瘤比较常的见并发症之一,尤其以肺癌为主,约占MPE发生原因的1/3,其次是乳腺癌和淋巴瘤。临床MPE的发生往往提示着肿瘤播散或病情进展至晚期,预后一般不良。大量胸腔积液造可成病人胸闷、气促、胸痛以及呼吸困难等症状,严重者甚至危及生命,所以积极有效地控制MPE是肿瘤临床治疗的一项重要内容,对于改善肿瘤患者症状,提高生存质量,延长生存期都有重大意义。目前治疗MPE的方法较多,但化疗药物毒副作用较大,手术等方法晚期病人多不能耐受,且短期内复发率仍然很高,患者生存质量较低。而中医药在MPE的治疗中发挥着西医药不可替代的作用,是治疗恶性肿瘤并发症的特色之一,目前已经被广泛应用于临床,尤其对于高龄、体弱病人,特别是不能手术、化疗的病人可作为首选治疗方法,疗效性和安全性较高。中药消水方是中国中医科学院广安门医院肿瘤科临床沿用多年的经验方,本方主要由生黄芪、白术、葶苈子、大枣、瓜蒌、五加皮、车前子、莪术、徐长卿、黄芩、半枝莲等组成,具有益气健脾、泻肺利水、祛瘀抗癌之功。前期临床研究发现中药消水方口服联合顺铂胸腔灌注治疗MPE65例,有效率达72.3%,并能明显改善患者生存质量,缓解症状,提高免疫功能,延长患者生存时间,但其作用机理尚不明确。研究发现MPE的产生、发展与其局部微环境密切相关,包括肿瘤细胞与局部的炎症环境、免疫细胞、基质细胞及相关细胞因子等的相互作用。Th17细胞是新近发现的不同于Th1、Th2型的免疫效应细胞,主要在慢性感染、免疫疾病以及肿瘤过程中发挥重要作用。有研究发现与外周血比较,Th17细胞在MPE微环境中的数量显著增加,并与患者预后相关。药理研究显示中药消水方中的主要药物黄芪、刺五加、白术、半枝莲等药物可调节机体免疫功能,改善肿瘤微环境及体内存在的免疫耐受状态,激活淋巴细胞和各种细胞因子活性,以达到抗肿瘤的效果。近期研究则发现方中五加皮的主要成分刺五加甙,莪术的主要成分榄香烯,黄芩主要成分黄芩苷等还能够调控Th17细胞的分化。基于此,我们推测消水方的作用机制可能主要通过对MPE微环境免疫状态,尤其对Th17免疫细胞及相关细胞因子网络的调控达到防治MPE目的。1目的本课题在门诊病例临床观察及临床经验总结基础上,拟通过建立C57BL/6小鼠肺癌MPE模型,采用中药消水方作为干预措施,通过分子生物学技术方法探讨中药消水方对实验小鼠肺癌MPE的抑制作用及对Th17免疫细胞及相关细胞因子、蛋白的影响,为中药的进一步开发应用提供临床与实验依据,推动中医药在治疗MPE中的应用。2方法临床观察：收集门诊单纯以益气健脾、泻肺利水为主的中药消水方辨证加减治疗的21例恶性胸腔积液患者,观察其治疗后胸腔积液的缓解,KPS评分的变化及临床症状的改善情况。实验研究：采用Lewis肺癌细胞胸腔注射建立C57BL/6小鼠肺癌MPE模型,建模第三天后,随机分为消水方组(XSF)、顺铂组(DDP)、消水方+顺铂组(XSF+DDP)、模型组(Control)、空白组(Blank)五组,给药10天,第14天时各组取10只小鼠处死取材,剩余小鼠用于观察生存期。给药期间,分别于第3、8、13天时采用小动物活体成像系统观察,并且每隔一天称重一次。取材时小鼠眼球取血,同时收集胸水并测量胸水体积、胸壁转移瘤个数以及转移瘤重。采用流式细胞技术分析MPE及外周血中Th17、Treg细胞数量；采用流式微球阵列法(CBA)以及酶联免疫吸附法(Elisa)检测MPE及外周血中IL-6、IL-17A、IL-21、IL-23和TGF-β1含量；采用蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测转移瘤组织中STAT-3蛋白表达水平,并通过SPSS18.0统计软件进行数据分析。3结果(1)21例单纯以中药消水方为主辨证加减治疗的患者的胸水缓解总有效为71.43%；KPS评分提高稳定率为80.95%；临床症状受益率,呼吸困难为91.67%,咳嗽为85.00%,胸痛为75.00%,乏力为77.78%,纳差为87.50%,未见明显不良反应。(2)采用Lewis肺癌细胞胸腔注射建立C57BL/6小鼠肺癌MPE模型,观察到模型组小鼠一般状况较差,成胸水率较好,胸水多为血性,胸壁转移较多。(3)采用小动物活体成像系统观察不同药物干预对小鼠Lewis肺癌MPE的作用,第8天成像时,XSF组与Control组相比,P>0.05,无统计学差异；而XSF+DDP组和DDP组分别与Control组相比,P<0.05。第13天成像时,各组荧光强度值XSF+DDP组<DDP组<XSF组<Control组；XSF组、DDP组、XSF+DDP组分别与Control组比较,P<0.05；且XSF+DDP组分别与DDP组和XSF组比较,P<0.05。(4)不同药物干预对小鼠体重变化的影响,第7天时,与Blank组相比,各组小鼠体重开始出现下降,P<0.05；其余各组体重相比：XSF+DDP组<DDP组<XSF组<Control组。第11天时,与Blank组相比,各组小鼠体重下降明显,P<0.01；XSF组与DDP组相比,XSF组与XSF+DDP组相比,均P<0.01。第14天时,与Blank组相比,各组小鼠体重显著下降,P<0.01; XSF组、DDP组、XSF+DDP两两比较,均P<0.05。(5)不同药物干预对小鼠生存期的影响,XSF组小鼠生存时间最长(22.00[95%CI=18.90～25.19]),XSF+DDP其次(21.00[95%CI=20.29～21.71]), DDP组最短(19.00[95%CI=16.98～20.02]),XSF组、XSF+DDP组分别与Control组比较,均具有显著差异(P=0.007<0.01,P=0.006<0.01)；此外XSF组与DDP组相比,P=0.043<0.05,也有明显差异。XSF组生命延长率(15.79%)大于XSF+DDP组(10.51%),而DDP组并不能提高小鼠生命延长率。(6)不同药物干预对小鼠肺癌胸腔积液量的影响,XSF+DDP组MPE体积最小(177±64ul), Control组最大(715±61u1)；各实验组与Control组相比,P值均小于0.01；XSF+DDP组分别与XSF组、DDP组比较,都具有统计学差异(P=0.047<0.05,P=0.013<0.05)。(7)不同药物干预对小鼠壁转移瘤个数的影响,XSF+DDP组转移瘤个数最少(2.5±1.0个),Control组最多(9.3±0.6个)。各实验组与Control组相比,P值均小于0.01；XSF+DDP组与XSF组比较,P<0.05；DDP组和XSF组比较,也具有差异,P<0.05。(8)不同药物干预对小鼠胸壁转移瘤重的影响,DDP组转移瘤重最轻(111.0±43.9mg),XSF+DDP组其次(297.6±144.5mg),XSF组转移瘤重最重(569.2±152.1mg)。各实验组与Control组相比,P值均小于0.01；XSF+DDP组、DDP组分别与XSF组比较,均P<0.01；XSF+DDP组和DDP组比较,也具有差异(P=0.01<0.05)。(9)各组小鼠MPE中Th17细胞含量,XSF组最高,为1.46±0.37%,明显高于DDP组和Control组的含量,差异均具有显著性(P=0.01<0.05,P=0.005<0.01),但是和XSF+DDP组比较,差异不明显(P=0.453>0.05);XSF+DDP组分别和DDP组、Control组比较,均有统计学意义(P=0.048<0.05,P=0.026<0.05)。各组小鼠外周血中Th17细胞含量,各个实验组和Control组含量均高于Blank组(0.17±0.07%),P值均小于0.05。其中XSF组(0.89±0.19%)、XSF+DDP组(0.744±0.22%)分别和Control组比较,具有统计学差异(P<0.05)；XSF组含量明显高于DDP组(0.60±0.31%),两者差异有统计学意义(P<0.05)。(10)各组小鼠MPE中Treg细胞含量,Control组最高,为13.94±2.89,XSF组最低,为6.47±1.71%；XSF组明显低于DDP组、Control组,统计学分析,差异均具有显著性(P=0.007<0.01,P<0.01)；此外XSF+DDP组分别和DDP组、Control组比较,也均有统计学意义,(P=0.048<0.05,P=0.003<0.01)。各组小鼠外周血中Treg细胞含量,各个实验组和Control组均明显高于Blank组(0.40±1.36%),P值均小于0.05。而Control组(3.12±0.53%)与实验组相比,都显著偏高,P值均小于0.01。各个实验组中,XSF组含量最高,XSF+DDP组含量最低,两者相比差异明显,P=0.036<0.05。(11)小鼠MPE中各细胞因子含量,IL-6表达：XSF组MFI值最高,为349.12±56.48,XSF+DDP组其次,为135.77±19.8,各组两两比较均具有明显差异,P<0.01。IL-17A表达：XSF+DDP组IL-17A的MFI值(1.64±1.01)明显高于XSF组、DDP和Control组,均具有统计学意义(P=0.027<0.05,P=0.005<0.01, P<0.001)。IL-21表达：其中DDP组IL-21的MFI值(6.32±1.49)明显高于XSF组、XSF+DDP组和Control组,P值均小于0.01；另外XSF+DDP和Control组相比,P=0.024<0.05,也表现出差异。IL-23表达：其中XSF+DDP组IL-23的MFI值最高(1.73±0.83),分别与XSF组、Control组相比,均具有统计学意义(P<0.01,P=0.006<0.01)；而XSF组最低(1.45±0.69),与DDP组相比,P=0.004<0.01,具有显著差异。TGF-β1表达：其中XSF+DDP组最低(8.84±4.74),Control组最高(42.67±1.78)。XSF组、DDP组和XSF+DDP组分别与Control组比较,具有统计学意义(P<0.01,P<0.01, P<0.01);XSF+DDP组与DDP组相比,P=0.006<0.01,也有统计学差异。(12)小鼠外周血中各细胞因子含量,IL-6表达：XSF+DDP组MFI值最高(6.98±6.47),Blank组最低(2.48±1.62)；XSF组、XSF+DDP组、Control组分别与Blank组相比,P值均小于0.01；XSF组、DDP组、XSF+DDP组分别与Control组相比,P值也均小于0.01；此外XSF+DDP组分别与XSF组和DDP组比较,也都具有差异(P<0.01)。IL-17A表达：其中XSF+DDP组MFI值(4.18±1.78)明显高于XSF组、DDP组、Control组和Blank组,P均小于0.01；另外XSF组分别与Control组、Blank组比较,具有显著差异(P=0.002<0.01,P=0.001<0.01,)。IL-21表达：XSF+DDP组MFI值(5.19±1.05)明显高于XSF组、DDP组、Control组和Blank组,均具有统计学意义(P=0.041<0.05,P=0.023<0.05,P<0.01,P=0.003<0.01)；另外DDP组分别与Control组、Blank组比较,也有显著统计学意义(P=0.002<0.01,P=0.001<0.01,)。IL-23表达：XSF+DDP组MFI值最高(1.98±1.90),Control组最低(1.46±0.60)；XSF组、XSF+DDP组、Control组分别与Blank组比较,均具有统计学意义(P=0.019<0.05,P=0.013<0.05,P=0.004<0.01); DDP组、XSF+DDP组分别与Control组分比较,也都有显著差异(P<0.01,P<0.01)；另外DDP组、XSF+DDP组分别与XSF组分比较,都具有明显差异(P<0.01,P<0.01)。TGF-β1表达：Blank组TGF-β1的浓度最低(30.15±10.77),与各组相比,P值均小于0.05,；各试验组中Control组最高,为42.67±1.78,分别与XSF组、DDP组和XSF+DDP组比较,P值均小于0.01；XSF+DDP组在各个试验组中最低,与XSF组相比,P<0.01。(13)各组小鼠转移瘤中STAT-3蛋白表达量,XSF+DDP组最高(1.770±0.534),XSF组其次(1.473±0.137)；XSF组、XSF+DDP组分别与Control组相比,具有统计学差异(P=0.014<0.05,P=0.014<0.05)；DDP组和XSF组比较,P=0.021<0.05,具有统计学意义,与XSF+DDP组比较,P=0.021<0.05,具有统计学差异。4结论(1)中药消水方为主辨证加减治疗治疗恶性胸腔积液具有较好疗效,且能提高患者生活质量,改善患者临床症状,安全性好,优势明显。(2)运用C57BL/6小鼠胸腔内注射Lewis肺癌细胞建立小鼠肺癌MPE模型成胸水率较好,模型质量较高。(3)中药消水方具一定抑制小鼠Lewis肺癌胸腔积液和胸膜转移瘤的作用,且与化疗药物联合应用时作用更加明显。(4)中药消水方可明显改善Lewis肺癌MPE模型小鼠体重下降,增强小鼠免疫功能,减缓恶液质发生；同时可以降低化疗药物对于小鼠体重的影响,增加化疗的耐受性,具有减毒增效的效果。(5)中药消水方可明显延长Lewis肺癌MPE模型小鼠的带瘤生存时间,且其作用相比于联合顺铂化疗更有优势；而顺铂化疗对于小鼠生存时间没有受益。(6)中药消水方在抑制转移瘤体增殖方面作用较弱,提示中药消水方减少MPE生成的机制可能主要途径不是通过抑制转移瘤生长来实现的,还可能存在其他复杂机制。(7)小鼠Lewis肺癌MPE微环境Th17、Treg细胞的含量明显高于外周血。模型组小鼠外周血Th17、Treg细胞的含量明显高于正常小鼠外周血含量。(8)中药消水方具有调节小鼠Lewis肺癌MPE及外周血中Th17和Treg细胞的作用,能上调Th17细胞表达,下调Treg细胞表达,纠正微环境中Th17/Treg细胞失衡,减轻MPE微环境免疫抑制状态,增强对于肿瘤的免疫作用。(9)中药消水方单独应用或者联合化疗应用均可上调小鼠Lewis肺癌MPE和外周血中IL-6、IL-17A、IL-23的表达,下调TGF-β1的表达,从而可能从局部和全身诱导初始Th0细胞向Th17细胞分化,促进肿瘤免疫作用；减少向Treg细胞分化,减少肿瘤免疫抑制作用。(10)中药消水方单独应用或者联合化疗应用均可显著提高小鼠Lewis肺癌MPE转移瘤中STAT-3蛋白的表达,促进Th17细胞分化、增殖,以及相关细胞因子表达,发挥治疗MPE作用。