研究背景及目的脑膜瘤是中枢神经系统最常见的肿瘤之一,占所有颅内肿瘤20%。2007版WHO中枢神经系统肿瘤病理分型,将其分为三个级别(WHOI-III,恶性程度递增)。近年来,随着病理技术的发展,WHO III级脑膜瘤(恶性脑膜瘤,malignant meningioma,MM)在脑膜瘤中的比例较前明显升高,占所有脑膜瘤15%-20%。病理分级是影响肿瘤预后最主要的原因[1-5]。以外科手术为主的综合治疗是目前主要治疗手段[6]。然而,即使经过正规综合治疗后,恶性脑膜瘤总体复发率高达80*%,,5年生存率几乎为0,其预后和颅内最恶性的胶质母细胞瘤类似。其较高的复发率和病死率仍使其成为颅内最难攻克的肿瘤之一。寻找新的治疗方式和手段,成为防治恶性脑膜瘤和改善预后的中心问题。恶性脑膜瘤是血供极其丰富的肿瘤,一方面,肿瘤内的血管网络系统保证肿瘤细胞的氧供、营养及代谢产物的排泄以促进肿瘤的生长；另一方面,肿瘤组织内血管管壁结构不完整,基底膜厚薄不一,利于瘤细胞进入管腔发生侵袭和转移。血管内皮细胞生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor A)被认为是肿瘤中调节血管生成最重要的因子,它与其受体结合激活酪氨酸激酶受体从而促进血管内皮细胞增殖,诱导新生血管生成。VEGF表达于60%脑膜瘤中,几乎100%表达于恶性脑膜瘤中[8]。贝伐单抗(bevacizumab)是针对VEGF的人源化单克隆抗体,它与内源性的VEGF竞争性结合VEGF受体,抑制内皮细胞的有丝分裂,减少新生血管形成,阻断肿瘤生长所需的血液、氧气和其他营养供应,抑制肿瘤生长。目前贝伐单抗已经成为恶性脑膜瘤治疗的一种新手段[8]。其在恶性脑膜瘤治疗中的安全性已经得到认可。然而,针对VEGF靶向治疗往往在使用寻找新的抗血管治疗靶点或联合靶向治疗方式,对延长恶性脑膜瘤患者总体生存期和提高生活质量,具有重要的意义。1999年,美国学者Maniotis等在黑色素瘤中发现了一种没有内皮细胞参与的微循环管道称为肿瘤血管生成拟态(vasculogenicmimicry, VM)[8]。它由肿瘤细胞自身模仿机体血管,形成网状管道样结构与原有血管相连。VM的提出对以内皮依赖性血管是肿瘤微循环唯一方式的传统观念提出了挑战,同时也是对肿瘤血管生成理论的重要补充。VM有助于解释某些恶性肿瘤高侵袭、高转移以及对抗血管治疗抵抗等的生物学行为。与经典的肿瘤血管生成相比,VM管壁主要由一层PAS阳性基底膜围成,外衬以肿瘤细胞而不是内皮细胞,VM管腔内有血浆和红细胞流动。管壁外衬的肿瘤细胞在释放蛋白水解酶溶解基底膜后能直接进入血液,更有利于肿瘤的侵袭和转移。在多种恶性肿瘤中发现VM的存在与患者的生存期及预后密切相关。随着对VM现象及其机制的深入了解,其在肿瘤的诊断、预测及治疗方面的临床应用价值将会逐步体现出来。VM发生机制尚不明确,相关研究主要集中在肿瘤细胞去分化、拟态血管结构特点及肿瘤微环境等方面。参与形成VM的肿瘤细胞模拟内皮细胞的功能和表型,而内皮细胞属于间充质细胞的一种,因而在VM形成过程中上皮性肿瘤细胞向间质性内皮细胞转分化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)扮演重要角色[12]。既然VM是恶性肿瘤一种非依赖VEGF的血管生成方式。我们设想贝伐单抗治疗恶性脑膜瘤效果不甚理想,在恶性脑膜瘤中可能存在一种非依赖VEGF的血管生成方式。因此,我们对12例恶性脑膜瘤进行免疫组化染色,结果发现,在6例(50%)恶性脑膜瘤中存在VM现象。然而,是什么导致恶性脑膜瘤中VM形成?为什么VM仅仅存在于部分恶性脑膜瘤中呢?1p36杂合性缺失(LOH),是恶性脑膜瘤预后不良最显著的分子事件。见于70-100%恶性脑膜瘤[13-15]。许多1p染色体的基因,包括CDKN2C, RAD54L, EPB41,GADD45A, RAD54L,和ALPL等,在恶性脑膜瘤中均有过研究,但是没有发现以上基因的异常能够解释恶性脑膜瘤生物学行为和不良的预后[16,17]。1p36缺失导致恶性脑膜瘤不良预后相关机制,值得进一步研究。本课题预先对30例恶性脑膜瘤利用iFISH检测1p36杂合性缺失状态,发现19例存在VM现象的恶性脑膜瘤中1p36均为缺失状态,而另11例无VM现象的恶性脑膜瘤中lp36无缺失。对19例1p36缺失的恶性脑膜瘤(LOH-MM)和11例无1p36缺失的恶性脑膜瘤(NLOH-MM)进行miRNA芯片分析,结果显示LOH-MM中有41个miRNAs表达上调两倍以上,有26个miRNAs表达下调两倍以上；其中miR-200a在LOH-MM中下调超过20倍。miR-200a作为miR-200家族的一员,在多数恶性肿瘤细表达为下调状态,并调控其下游靶基因表达[18-21]。我们查阅文献和通过生物信息学分析,miR-200a可以直接靶击P-catenin的mRNA (CTNNB1转录),miR-200a下调可能通过激活经典wnt通路并引起EMT,影响肿瘤发生发展。为验证这种假设是否在LOH-MM存在,我们利用免疫组化、western等技术发现与NLOH-MM相比,LOH-MM中经典wnt通路为激活状态,主要表现为P-catenin向胞浆和细胞核转移；同时EMT的一些标记物,如E-cadherin在LOH-MM中明显下调,而N-cadherin表达则明显上调。结合前期工作基础,我们推断VM现象在恶性脑膜瘤中发生可能和1p36缺失导致的EMT有关,1p36缺失,可通过下调miR-200a表达,激活经典wnt通路,引起EMT,引起VM形成,从而导致贝伐单抗针对VEGF的靶向抗血管生成治疗无效,并引起肿瘤增殖和侵袭能力加强,导致肿瘤预后不良。而同时针对VEGF和wnt通路的靶向治疗可能对治疗恶性脑膜瘤具有潜在的临床治疗意义。本研究若顺利进行,可对明确1p36缺失作为恶性脑膜瘤不良预后的分子事件提供了理论依据,同时为恶性脑膜瘤的综合治疗提供了新的靶点和联合治疗方式,对提高患者预后和降低术后复发率有着重要的意义。研究内容与方法1.不同级别脑膜瘤中1p36缺失和miR-200a下调的相关性研究。收集南方医科大学附属南方医院神经外科2013年4月至2015年12月经病理确诊的肿瘤组织标本60例,其中WHO I级脑膜瘤30例,WHO Ⅱ级脑膜瘤20例,WHO Ⅲ级脑膜瘤10例,以上病例均有完整的术前,术后影像学及临床资料。实验方法：运用位点特异性(LSI)1p36探针荧光原位杂交技术(FISH)对恶性脑膜瘤细胞(WHOⅡ-Ⅲ级)和普通肿瘤细胞(WHO I级)进行1p36位点缺失检测；同时对两类细胞中miR-200a和正常蛛网膜分别进行荧光定量检测,统计分析miR-200a在各组中的表达情况,并分析miR-200a与1p36缺失的相关性。2.不同级别脑膜瘤β-catenin蛋白的表达水平及肿瘤血管生成拟态(vasculogenicmimicry, VM)的初步探索分别取上述3种级别脑膜瘤石蜡组织标本各10例,采用免疫组织化学方法检测β-catenin核转移情况并统计；采用过碘酸雪夫氏反应(PAS)与CD31双重染色法检测各级别脑膜瘤VM的发生率并统计；取上述三类级别脑膜瘤原代细胞分别进行三维细胞培养,建立VM模型并观察比较不同级别脑膜瘤的血管生成能力。3.下调miR-200a激活Wnt/β-catenin信号通路促进恶性脑膜瘤细胞增殖迁移和血管生成的相关研究建立恶性脑膜瘤(WHO Ⅲ级)原代细胞培养模型并验证。通过慢病毒转染上调1miR-200a的脑膜瘤细胞作为过表达组(miR-200a+),下调组为(miR-200a-),设置阴性对照组(negative control),采用Westem blot技术检测各组细胞内β-catenin蛋白和EMT相关蛋白(zebl, Twist 1,E-cadherin,vimentin)的表达水平,利用细胞免疫荧光观察各组细胞β-catenin核转移情况,检测各组细胞增殖能力(CCK-8细胞活力检测,细胞凋亡检测,细胞周期检测),检测各组细胞体外迁移、侵袭能力(细胞划痕实验、Transwell小室实验),以及细胞裸鼠皮下致瘤能力检测等；进行三维细胞培养检测各组细胞的血管生成能力。4.统计学方法采用SPSS 19.0软件进行统计学处理。计量资料用x±s表示,组间比较采用两独立样本t检验。以P<0.05表示具有统计学差异。结果1.不同级别脑膜瘤中1p36缺失和miR-200a下调的相关性研究。运用FISH探针技术检测不同级别脑膜瘤1p36缺失情况,结果显示30例WHOI级脑膜瘤均未见缺失,WHO II-III级脑膜瘤缺失率为63.3%(19/30)。利用qRT-PCR检测miR-200a下调相关情况,结果发现WHO I级脑膜瘤中下调2-3倍,LOH-MM(1p36缺失的恶性脑膜瘤)下调倍数为26-37倍,NLOH-MM(1p36缺失的恶性脑膜瘤)下调倍数为3-5倍。结果表明了1p36缺失和miR-200a下调主要存在于恶性脑膜瘤中,且1p36缺失和miR-200a下调倍数存在明显相关关系(p<0.05)2.不同级别脑膜瘤β-catenin蛋白的表达水平及肿瘤血管生成拟态(VM)的初步探索。运用免疫组化染色观察肿瘤中β-catenin蛋白的表达水平,结果显示肿瘤病理级别越高,β-catenin蛋白出现胞浆转移、核转移程度越高。采用过碘酸雪夫氏反应(PAS)与CD31双重染色后发现VM在恶性脑膜瘤的发生率为15%左右,WHO I级脑膜瘤未发现VM现象。脑膜瘤原代细胞三维培养结果显示WHO I级脑膜瘤很难形成VM结构,而恶性脑膜瘤(WHO II-III)较易形成典型VM结构,此结果也和组织标本PAS-CD31共染结果一致。3.下调miR-200a激活Wnt/β-catenin信号通路促进恶性脑膜瘤细胞增殖迁移和血管生成的相关研究慢病毒转染成功后,利用western blot方法检测各组细胞EMT和VM相关蛋白表达水平,结果显示(miR-200a-)组细胞,β-catenin、twist 1、VE-cadherin蛋白表达上调,E-cadherin表达下调,而(miR-200a+)组上述蛋白变化趋势相反。由此说明miR-200a下调后可激活Iβ-catenin/Wnt通路,引发EMT过程,VE-cadherin(VM相关蛋白)的变化说明miR-200a下调亦可能是影响VM形成的间接因素。细胞免疫荧光结果发现miR-200a下调后细胞β-catenin蛋白出现明显核转移,而(miR-200a+)组未出现,说明miR-200a下调可靶向激活β-catenin蛋白表达。同时于各组细胞进行增殖侵袭功能实验后,发现(miR-200a-)组细胞相较于(miR-200a+)组细胞拥有更强的细胞活力、增殖侵袭和抗凋亡能力。裸鼠皮下成瘤后(miR-200a-)组细胞成瘤体积更大。转染后细胞进行三维培养亦同样发现(miR-200a-)组细胞可形成典型VM结构,而(miR-200a+)组不易形成。结论VM现象在恶性脑膜瘤中发生可能和1p36缺失导致的EMT有关,1p36缺失,可通过下调miR-200a表达,激活经典wnt通路,引起EMT,引起VM形成,从而导致贝伐单抗针对VEGF的靶向抗血管生成治疗无效,并引起肿瘤增殖和侵袭能力加强,导致肿瘤预后不良。而同时针对VEGF和wnt通路的靶向治疗可能对治疗恶性脑膜瘤具有潜在的临床治疗意义。本研究结果为明确1p36缺失作为恶性脑膜瘤不良预后的分子事件提供了理论依据,同时为恶性脑膜瘤的综合治疗提供了新的靶点和联合治疗方式,对提高患者预后和降低术后复发率有着重要的意义。