类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）是一种病因未明的慢性系统性自身免疫病,其病理特征是手、足小关节的多关节侵蚀性、对称性关节滑膜组织炎症病变。目前治疗RA的药物有很多,其中,甲氨蝶呤（Methotrexate,MTX）作为改善病情抗风湿药（disease-modifying antirheumatic drugs,DMARDs）已被国际上公认为一线治疗药物,然而在临床实践中,耐药性是限制MTX疗效的主要问题,同时,其毒副作用较为明显,且部分患者不能良好响应。在此背景下,许多以MTX为基础的联合疗法被引入临床实践,以提高疗效,减少副作用。这一策略成功的关键之一是充分刻画药物-药物相互作用（drug-drug interactions,DDI）的特征,而更好地理解影响MTX代谢因素可能更为重要。考虑到MTX的高风险和狭窄的治疗浓度窗口,为了达到更好的治疗目的而避免不良后果,在使用MTX时不仅要注意进行个体化血药浓度监测,还要对可能引起MTX血药浓度波动的因素如病理条件下等密切关注。因此,本研究着重探究炎症病理条件下MTX的药代动力学特征,及以MTX为基础的联合用药对RA临床疗效与MTX排泄的影响。目的:明确炎症条件下的MTX药代动力学特征,并进一步探究以MTX为基础的联合用药对RA临床疗效与MTX排泄的影响。方法:1.运用LC-MS/MS方法对MTX的检测条件进行了优化,考察该方法的专属性,建立了标准曲线,并对精密度和回收率进行考察。同时我们建立大鼠胶原型关节炎（collagen induced arthritis,CIA）和佐剂型关节炎（adjuvant induced arthritis model,AIA）,分别一次灌药MTX（1mg/kg）,并用以上建立的LC-MS/MS法测定正常和模型大鼠血浆中MTX的浓度,初步探索MTX在炎症病理条件下的药代动力学特征,并采用细胞进行摄取实验以探究机体排泄MTX的功能活性。2.建立大鼠AIA模型,并分别给予布洛芬（Ibuprofen,Ibu）（100 mg/kg/day）和来氟米特（Leflunomide,Lef）（6 mg/kg/day）三周。通过Q-PCR、ELISA检测大鼠体内的促炎细胞因子TNF-ɑ、IL-6、IL-1β表达,连同关节炎肿胀评分、组织病理学检查共同评估联合用药临床疗效;采用LC-MS/MS法测定尿液、肾切片、肾灌注液中给药不同时间后MTX的药动学行为;随后,我们又进一步在体外用MDCK（NBL-2）肾小管上皮细胞进行了转运实验。最后,对摄取和转运过程中可能涉及到的能量代谢相关指标（ATP和乳酸）进行了检测。结果:1.与正常组相比,AIA大鼠和CIA大鼠表现出明显的足爪肿胀,同时TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎因子表达明显增加;我们成功优化现有条件下的LCMS/MS法来检测MTX的浓度,其专属性、精密度和回收率均显示良好;同时我们发现MTX在AIA和CIA模型中的口服吸收均提高,选用效果更显著的AIA模型进行MTX体内药动学行为干预研究,结果表明相比于正常组,AIA大鼠体内暴露量明显降低,加速了MTX的排泄,在使用丙磺舒（Probenecid,Pro）后显著逆转了MTX的排泄;此外,我们体外通过HEK-293T细胞作用不同时间的摄取实验,发现在0-4h对MTX的摄取呈上升趋势,在2 h左右达到高峰,接下来我们选用MTX作用2 h这一时间点进行摄取实验,结果显示相比正常组,用AIA大鼠血清培养组中细胞对MTX的摄取明显降低,在加入Pro后逆转了这一现象。2.Ibu和Lef治疗可以明显改善AIA大鼠体内的炎症细胞因子和足爪肿胀指数等整体指标,同时可以显著缓解关节和肾脏组织的病理改变;通过Q-PCR、ELISA法我们发现给药组还可以显著降低大鼠肾脏组织中TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎细胞因子的基因和蛋白表达;研究还表明,在分别与Ibu和Lef联合用药后,尿液中MTX浓度降低,提示可能抑制了MTX的排泄;同时通过肾切片摄取实验结果显示Ibu和Lef减少了MTX在肾脏部位的摄取,从而增加体内MTX的浓度;此外,细胞转运实验也进一步证明了,炎症条件下细胞加速了对MTX的转运,而与Ibu和Lef联合用药可以逆转炎症对MTX转运的加速。最后,检测细胞摄取MTX的浓度水平明显与ATP和乳酸水平相关。综上所述,我们从不同层面证明炎症病理条件可以改变MTX的药代动力学特征,而分别在与Ibu和Lef联合用药治疗后不仅产生明显的临床疗效还逆转了炎症对于MTX药代动力学行为的改变。结论:在本研究中我们通过成功优化LC-MS/MS法来探究炎症病理条件下对MTX的药代动力学的影响,结果表明炎症病理加速了肾脏对MTX的摄取,从而促进了MTX的排泄;同时证明联合用药经典抗炎药物Lef和Ibu可以一定程度上逆转炎症条件下导致的MTX排泄,从而提高MTX的疗效。