【摘 要】
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H7N9亚型禽流感（Avian Influenza,AI）是由H7N9亚型禽流感病毒（Avian Influenza Virus,AIV）引起的急性、高度传染性的呼吸道疾病。H7N9亚型禽流感危害了家禽养殖业的发展,同时可能感染人类,对公共卫生安全造成较大的威胁。血凝素（Hemagglutinin,HA）蛋白作为H7N9 AIV表面最主要的抗原蛋白,它在受体识别、与宿主细胞膜融合、致病性等多方面都
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H7N9亚型禽流感（Avian Influenza,AI）是由H7N9亚型禽流感病毒（Avian Influenza Virus,AIV）引起的急性、高度传染性的呼吸道疾病。H7N9亚型禽流感危害了家禽养殖业的发展,同时可能感染人类,对公共卫生安全造成较大的威胁。血凝素（Hemagglutinin,HA）蛋白作为H7N9 AIV表面最主要的抗原蛋白,它在受体识别、与宿主细胞膜融合、致病性等多方面都具有重要作用,是禽流感亚单位疫苗的首选抗原蛋白。研究证实HA蛋白的跨膜区（Transmembrane,TM）会影响HA蛋白的耐热性,进而影响HA蛋白的免疫原性。所以,本研究利用杆状病毒昆虫细胞表达系统表达H7N9 AIV的HA蛋白以及跨膜区修饰后的HA（TM）蛋白,比较两者的耐热性差异,并通过动物试验比较HA蛋白跨膜区修饰前后两种亚单位疫苗的免疫原性差异。本研究首先对H7N9亚型AIV HA基因的TM进行修饰,再对其核苷酸密码子进行了优化。利用杆状病毒昆虫细胞表达系统,表达获得了H7N9 HA蛋白和TM修饰后的蛋白H7N9 HA（TM）蛋白。Western-Blot试验结果表明两种蛋白均已表达,大小约为63 k Da,与预期大小一致。血凝试验结果显示H7N9 HA蛋白血凝效价最高为15 log2,H7N9 HA（TM）蛋白的血凝效价最高为14 log2。将H7N9 HA蛋白和HA（TM）蛋白经HA效价测定后统一稀释至血凝效价12 log2,经不同温度处理30 min后发现HA（TM）蛋白的耐热性有所提升,特别在48℃处理30 min后,H7N9 HA蛋白已无血凝性,H7N9 HA（TM）蛋白仍具有33.3%的血凝性。将H7N9 HA蛋白和H7N9 HA（TM）蛋白稀释至血凝效价为12 log2配合SEPPIC ISA 201VG佐剂配制成亚单位疫苗。将SPF鸡随机分成3组,每组12只,分别为H7N9HA组、H7N9 HA（TM）组及PBS对照组,其中疫苗组SPF鸡免疫对应的HA蛋白亚单位疫苗,PBS对照组SPF鸡免疫PBS,免疫一次,免疫剂量为0.3 m L/只,免疫后第三周用200μL 10~6EID50剂量的H7N9病毒进行攻毒试验。免疫后第二、第三周的采集血清测定HI抗体滴度,结果表明:免疫后的第二周,两个疫苗组的HI抗体效价均在4 log2以上,H7N9 HA（TM）组略高于H7N9 HA组,但差异不显著（P＞0.05）;免疫后的第三周,两个疫苗组的HI抗体效价均在5 log2以上,H7N9 HA（TM）组略高于H7N9 HA组,但两组差异不显著（P＞0.05）。攻毒后,PBS对照组的SPF鸡在3天内全部死亡,H7N9 HA组、H7N9 HA（TM）组至实验结束均无发病症状,存活率均为100%。攻毒后3、5、7、9和11天采集咽拭子和泄殖腔拭子进行排毒检测。排毒情况如下:H7N9 HA（TM）组在攻毒后共检测到1只鸡排毒,该疫苗组的排毒率为8.33%;H7N9 HA组共检测到2只鸡排毒,该疫苗组的排毒率为16.67%。对病毒分离阳性拭子的病毒滴度进行进一步的测定,结果显示H7N9 HA（TM）组的病毒滴度低于H7N9 HA组。综上所述,本研究利用杆状病毒昆虫细胞系统表达的H7N9 HA（TM）蛋白的耐热性优于比HA蛋白,H7N9 HA（TM）制备成的亚单位疫苗免疫原性也优于比H7N9HA蛋白。本研究结果为H7N9禽流感的防控提供更多的候选疫苗。
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