【摘 要】
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猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）,亦称为“蓝耳病”,是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）引起的以出现母猪繁殖障碍和新生仔猪呼吸道疾病为主要症状的一种高度接触性和高死亡率的传染病。目前,PRRSV类NAD
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猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）,亦称为“蓝耳病”,是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）引起的以出现母猪繁殖障碍和新生仔猪呼吸道疾病为主要症状的一种高度接触性和高死亡率的传染病。目前,PRRSV类NADC30流行毒株对我国养殖业造成重大危害,尚无有效疫苗进行防治。研究表明,PRRSV的GP5、GP3和M 3基因与其保护性免疫相关。而γ干扰素（Interferon-gamma,IFN-γ）和白细胞介素-18（Interleukin-18,IL-18）在细胞免疫方面具有重要作用,作为分子免疫佐剂方面应用前景广阔。伪狂犬病（Pseudorabies,PR）,也被称为猪I型疱疹病或奥耶兹氏病,是由伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）引起的以新生仔猪的神经症状和死亡、育肥猪的呼吸系统疾病和妊娠母猪的生殖功能障碍为主要表现的传染性疾病。PRV Bartha-K61疫苗已在生产上使用多年,清晰的遗传背景使其作为病毒载体的安全性有了保证。本研究在实验室前期建立的以低拷贝质粒p Belo BAC11为载体构建的猪伪狂犬病毒Bartha-K61株感染性克隆的基础上,利用Red/ET重组技术结合位点特异性重组系统,对感染性克隆p Belo BAC11-Bartha-K61进行了TK、g G基因与PRRSV类NADC30毒株GP3-GP5-M基因、IL-18-IFN-γ的替换修饰,成功获得了重组拯救病毒,并对重组病毒的生物学特性进行研究。研究结果如下:1.本研究构建了含有PRV的TK或g G基因同源臂的中间转移载体,将PRRSV GP3-GP5-M置于三种启动子下游（TK原启动子ori、CMV启动子、CAGGS启动子）,将IL-18-γ置于g G原启动子下游。将扩增的各线性片段电转化于表达Rec ET重组酶的E.coli GB2005-dir感受态中进行线线同源重组,形成含有目的基因的质粒,通过抗性筛选、PCR鉴定及测序验证得到正确的克隆p BR322-spect-TK-ori-PRRSVNADC30-like-GP3-GP5-M-lox P-genta,p BR322-spect-TK-CMV-PRRSV-NADC30-likeGP3-GP5-M-lox P-genta,p BR322-spect-TK-CAGGS-PRRSV-NADC30-like-GP3-GP5-Mlox P-genta,p BR322-spect-g G-IL-18-IFN-γ-lox P-kan。2.本研究分别先后对Bartha-K61的TK、g G基因进行缺失替换。通过在中间转移载体中预设的Xho I、Afl II酶切位点,酶切获得线性片段后,电转化于表达Redαβ重组酶的E.coli GB2005-red感受态,在重组酶的作用下进行线环重组,分别用PRRSV-NADC30-like-GP3-GP5-M和IL-18-IFN-γ替换TK和g G基因,得到含有lox P特异性重组位点的克隆。再通过诱导特异性重组酶Cre的表达来达到抗性消除的目的,成功构建出3种重组质粒,经病毒拯救,获得重组病毒r Bartha-K61-△TK/ori-GP3-GP5-M-△g G/IL-18-γ,r Bartha-K61-△TK/CMV-GP3-GP5-M-△g G/IL-18-γ,r Bartha-K61-△TK/CAGGS-GP3-GP5-M-△g G/IL-18-γ。3.本研究同时对三种重组病毒在PK-15细胞上的增殖特性、基因转录水平、遗传稳定性等进行了分析。病毒生长曲线测定结果显示,与母本病毒（Bartha-K61）、拯救病毒（r Bartha-K61）相比,总体增长趋势一致,于36 h达到峰值,且无显著性差异（p＞0.05）。基因转录水平结果显示三种重组病毒在m RNA水平上的表达量均较高,且能表达外源蛋白IL-18。重组病毒在PK-15细胞上连续传代15代,均能出现病变且外源基因能稳定存在。说明三种重组病毒均具有良好的遗传稳定性及体外复制能力。本研究成功构建了三种以IL-18和IFN-γ作为分子佐剂,表达PRRSV类NADC30毒株的GP3-GP5-M基因的重组伪狂犬病毒,为未来对抗PRV和PRRSV共感染的二联疫苗研发提供思路。
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