本论文包含两部分内容，第一部分为“新型HIV－1融合抑制剂的研究”，第二部分为“基于多肽六股螺旋的人工模拟酶研究”。一、新型HIV－1融合抑制剂的研究融合抑制剂是继逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂成功上市之后的第三类抗HIV药物。主要针对病毒入侵靶细胞的融合环节。相比于前二类抗HIV药物，融合抑制剂在病毒侵入靶细胞前发挥作用，在感染的初始环节切断HIV-1的传播。其中多肽类融合抑制剂T-20已于2003年上市。目前，T-20在临床上的问题主要是耐药性，生物利用度低，价格昂贵等。因此，如何解决临床耐药性成为研究融合抑制剂（主要是C肽抑制剂）的重点，迫切需要寻找新的抗HIV靶点。为提高抑制剂与靶标的亲和力，多价药物是一个很好的策略。多价抑制剂，它是一种高效的设计策略，通过影响配体与靶标的结合焓变和熵变来达到减小配体-靶标解离常数的目的，综合考虑二者的影响，优化多价药物分子结构，从而提高其活性。已有多篇文献报道了，以药物多价化为思路，大幅提高活性的成功案例。在本文中，我们针对HIV-1gp41N末端重复序列为分子靶标设计融合抑制剂。以C肽为模板，通过共价交联，形成类似发夹结构的相互平行的两条肽链，藉此研究二价C肽分子不同连接位点与不同连接臂对抗HIV融合活性的影响。我们在活性多肽序列的末端引入半胱氨酸，而半胱氨酸与活性序列之间是通过连接臂相连。正是基于这样一个设计，我们只需制备一条多肽，经过氧化即可得到二价分子。二价分子之间通过，末端半胱氨酸巯基相连。这样的制备方法高效，高产率，清洁。我们主要设计了2大类二价抑制剂，以T-20或C34系列为模板长肽系列，和以C29,C22与SC22EK系列为模板的短肽系列。T-20或C34系列是目前研究较多的肽序列，从这两条序列展开研究，便于寻找二价抑制剂的规律。所有肽序列分别设计了N末端或者C末端交联的二价分子，以寻找活性最佳化合物。短肽相比长肽，在生物利用度和合成成本上具有优势，因此，针对短肽的二价分子比长肽更加具有应用意义。多肽的合成采用标准的Fmoc固相合成法，多肽的纯化采用制备液相进行纯化，多肽结构采用MALDI-TOF进行鉴定，纯度采用HPLC测定，所有化合物纯度均大于94%。一共合成了41个化合物，其中C34与T-20系列20个，C29系列13个，C22系列一共合成了5个化合物，SC22EK系列一共3个。通过细胞－细胞融合实验评价抗HIV-1活性。在研究中，我们考察了交联位点，连接臂以及活性肽序列对协同效应的影响。由C34或T-20的N末端偶联形成的二价分子，以及C末端偶联形成的二价分子均具有协同效应。但是，C34与T-20系列二价化合物协同效应明显，但其绝对活性仍然未超过模板序列。这可能是由于一维序列设计所造成的。而C29系列化合物，仅在N末端能够发生协同效应。C22系列化合物由于其本身亲和力过低，N末端与C末端均未观察到协同效应的出现。连接臂对二价协同效应的影响较为明显。其中，在C34的N末端引入β-丙氨酸作为连接臂，能够最大程度提高活性。β-丙氨酸作为连接臂的二价分子，活性提高最大。由单价分子CβA-C34，经过氧化形成二硫键连接的二价分子（CβA-C34）₂，其结构为（Cys-CONH-CH₂CH₂CO-C34）₂，融合活性从43.7nM提高到了6.4nM,显示二价抑制剂中两条C肽链间出现了具有良好的协同效应。活性序列的选择对二价协同效应尤为重要。多价抑制剂的设计需满足一定的条件。C34与T-20系列化合物，其绝对活性仍然未超过模板序列，可能是由于与靶标结合的迁移率造成的。为此，我们进一步缩短肽序列，将肽序列缩短为29个氨基酸的C29。以C29为模板的二价抑制剂出现了非常明显的活性提升。其中，单价分子CAca-C29[Cys-NH（CH₂CH₂O）₄CO-C29]，经过氧化形成二硫键连接的二价分子（CAca-C29）₂[（Cys-NH（CH₂CH₂O）₄CO-C29）₂]，融合活性也从49.02nM提高到了5.71nM,两条C肽链间体现出了的协同效果（远大于模板序列C29融合活性118nM）。此外，我们设计的C29系列二价化学其绝对活性也达到了与C34相当的活性水平。C29系列化合物，交联成二价抑制剂，相对模板序列C29，其活性提高了2.4～35倍（C29-AcaC除外）。其中活性提高最大的（CTegβA-C29）₂，其结构为（Cys-CONH（CH₂CH₂O）4-CONH-CH₂CH₂CO-C29）₂，融合活性提高到了3.08nM，活性已经与高活性序列C34和T-20相当，具有临床意义。我们又进一步在C末端截短肽序列，发现难以提升活性，其原因可能是由于C22的亲和不够，难以发生协同效应。我们在C22序列中设计基础上引入Glu-Lys，来替身其螺旋性，改造后的CAca-SC22EK [Cys-NH（CH₂CH₂O）₄CO-SC22EK]出现了非常明显的活性提高。其活性从38.6nM提高到了4.9nM。HIV-1二价融合抑制剂的设计给我们设计高效的HIV融合抑制剂提供了一些思路，值得进一步研究。二价化的短肽抑制剂，融合活性高，达到了与长肽C34，T-20相当的水平。而且，短肽相比长肽，在生物利用度和合成成本上具有明显优势。二、基于多肽六股螺旋的人工模拟酶研究天然酶在极端的化学条件或者物理条件下会由于其失去高级结构而失去催化活性。在本文中，我们设计通过分子间共价键来稳定多肽链间三级的策略，以稳定在极端的化学条件或者物理条件下的高级结构，使其仍然保持高效的催化活性。我们构建一个共价键稳定的多肽六股螺旋，在其上引入相互协同的组氨酸作为功能基进行人工模拟酶研究。该六股螺旋来源于HIV-1gp41的核心结构。一共设计了单共价键交联的六股螺旋（6HB-1）组，2个共价键交联的六股螺旋（6HB-2）以及2个交联组相对应的未交联对照组，共计4组6HB的实验。实验用多肽的合成采用Fmoc固相合成法，多肽的纯化采用制备液相进行纯化，多肽结构采用MALDI-TOF进行鉴定，纯度采用HPLC测定，所有化合物纯度均大于97%。螺旋间的共价键引入，是通过C肽与N肽之间的酰基转移反应来发生。单共价键交联的六股螺旋（6HB-1）和含有2个共价键交联的六股螺旋（6HB-2）分别在高温，高盐浓度和高表面活性剂条件下测试其催化能力和测定高级结构含量。分别评价高温，氢键作用，疏水作用对共价键稳定6HB的影响。首先，合成交联实验发现，共价键的引入完全不影响螺旋的组装。其次，在活性测试中，共价键的稳定体现出了明显的优势。从饱和动力学的结果可以看出，共价键的引入，完全不影响酶系统的催化特征，像天然酶一样仍然具有饱和动力学特征。在高温的条件下，双共价键稳定的6HB结构更加的稳定。在50℃以上，共价键稳定的6HB其催化能力明显优于对照组（不含共价键的6HB）。从绝对活性上来看，在80℃的条件下，双共价键交联组仍然保持着较高的催化活性。4M的脲，几乎完全使得未交联的6HB失去螺旋。而6HB-2即使是在8M脲下几乎仍然保持了100%的螺旋比例。而双共价键稳定的6HB-2则8M脲条件下仍然保持了57%水解能力。在1%的Brij35浓度下，6HB-1和6HB-2保留了～50%的水解活性，而不含共价键的6HB-1C和6HB-2C只保留了¹0%的水解活性。第三，我们以酰基转移的方式引入了六股螺旋间的分子间共价键。并以此稳定具有水解催化能力的人工模拟酶。同时，在高温，高盐浓度和高表面活性剂条件下测试结果发现。共价键的稳定因素使得酶保持了极端环节的催化能量。也许，这个结论能够为理解极端化学环境或者物理环境条件下仍然存在神秘现象提供一些理论参考意义。