研究背景食管癌（esophageal cancer,EC）在消化道肿瘤中很常见,发病率和死亡率各国差异很大。我国的食管癌发病率和死亡率均排在全球首位,发病患者以40岁以上的男性为主。目前,食管癌主要的治疗方式仍然是手术、放疗、化疗。近年来,虽然有新的靶向及免疫药物问世,但晚期食管癌患者的生存率仍较低。复发和远处转移是其主要的死亡原因。因此,为提高食管癌的治疗疗效,首要的任务就是如何控制肿瘤细胞的侵袭、转移。近十余年来,科学家从表观遗传学的角度研究肿瘤的发生、发展机制,获得了较多进展。一些最新的研究表明,RNA转录后的甲基化调控,对肿瘤的发生和发展可以起到非常重要的作用,为研究癌症转移的机制提供新的方向。目前,已知RNA的修饰超过100种。在真核生物中,mRNA最常见的内部修饰包括m6A、m1A、m5C等,其中m6A占到RNA甲基化修饰的80%,并且是可逆的。目前发现,m6A 修饰可以在 microRNA,circRNA,rRNA,tRNA 和 snoRNA 上发生。研究发现,多种病理过程中均有RNA m6A修饰参与,如癌细胞生长、神经系统疾病、胚胎干细胞生长分化和T细胞稳态等,特别是在癌症中可能发挥的作用引起了科学家浓厚的兴趣。研究发现,m6A修饰主要发生在腺嘌呤上,由“Writer”、“Eraser”和“Reader”决定其功能。“Writer”是由METTL3,METTL14等四部分构成的甲基转移酶复合体,其中METTL3是这个复合体的关键成分,它一共包含580个氨基酸序列,其中锌指结构域（zinc finger domain,ZFD）和甲基转移酶结构域都是酶活性所必需的,ZFD结构域负责靶标识别,而甲基转移酶结构域,又称为MT-A70,主要负责转移甲基。已经有大量研究证明,METTL3的异常表达可通过影响RNA的m6A修饰水平,或者通过与mRNA的翻译起始装置相互作用,进而来影响肿瘤的发展。但METTL3的异常水平对不同肿瘤的调控作用非常复杂,且变化较大,究其原因,可能是因为METTL3作用的靶基因不同。目前的研究显示,METTL3在大部分肿瘤中起到致癌基因的作用,但小部分文献报道,METTL3在部分肿瘤中发挥抑癌基因的作用。比如,Lin SB等发现METTL3在肺癌细胞中起到癌基因的作用,能促进肺癌细胞的增殖、侵袭和转移,而Li X等发现METTL3可以抑制肾肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移,从而发挥抑癌基因的作用。但目前关于METTL3对食管癌的作用及机制尚未见报道,本实验初步进行了探讨。第一部分METTL3对食管鳞癌恶性生物学行为的影响研究目的为探讨METTL3对食管鳞癌生长、凋亡和侵袭、迁移的影响,我们通过检测METTL3在正常食管细胞（HEEC）、两种常见食管癌细胞株（Eca-109、KY-SE150）以及食管鳞癌组织中的表达,明确METTL3在细胞系（HEEC、Eca-109、KY-SE150）及EC组织、癌旁组织中的表达情况;并进一步通过影响食管癌细胞株中METTL3的表达,检测其对食管癌细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移等方面的影响。采用小鼠皮下移植瘤模型进行体内实验的初步验证。研究方法1.通过实时荧光定量PCR检测METTL3在正常食管细胞株（HEEC）及两种常见食管癌细胞株（Eca-109、KY-SE150）中的表达情况。2.通过免疫组化检测食管鳞癌组织细胞及相应癌旁组织细胞中METTL3的表达情况;根据IHC染色评分结果,对两者中METTL3表达水平的差异进行统计分析。3.通过将食管癌细胞株Eca-109和KY-SE150转染对照shRNA和干扰METTL3 的 sh-METTL3,建立对照（NC）和稳定低表达 METTL3（METTL3-KD）的Eca-109和KY-SE150细胞株;通过将食管癌细胞株Eca-109和KY-SE150转染对照质粒和过表达METTL3的pcDNA3.1-METTL3,建立对照（NC）和稳定高表达 METTL3（METTL3-OV）的 Eca-109 和 KY-SE150 细胞株;随后进行 Western blot检测METTL3的表达变化,证明转染成功后并进行接下来的实验;4.通过CCK-8生长曲线及平板克隆实验,检测干扰和过表达METTL3对食管癌细胞株Eca-109和KY-SE150增殖能力的影响;通过流式细胞术检测干扰和过表达METTL3对Eca-109和KY-SE150食管癌细胞株凋亡的影响;通过划痕实验和Transwell小室迁移和侵袭实验,检测干扰和过表达METTL3对Eca-109和KY-SE150食管癌细胞株侵袭、迁移能力的影响。5.通过慢病毒感染,建立EC细胞株Eca-109-shMETTL3及对照细胞株Eca-109-NC,选择6-8周雌性BALB/c Nude裸鼠,皮下注射两组细胞,观察两组小鼠成瘤能力的变化。研究结果1.METTL3在食管癌细胞中高表达实时荧光定量PCR结果显示:在正常食管细胞株（HEEC）及食管癌细胞株（Eca-109、KY-SE150）中均有METTL3表达;且其在食管癌细胞株中的表达较正常食管细胞株中的表达明显升高,两者有统计学差异（P＜0.05）;2.METTL3在EC组织肿瘤细胞中的表达较癌旁正常组织细胞中的表达高免疫组化结果显示:METTL3主要在肿瘤细胞的细胞核中表达,呈淡黄色、棕黄或褐色颗粒。相较于肿瘤周围正常组织,METTL3在EC组织肿瘤细胞中的表达更高,两者有统计学差异（P＜0.05）。3.METTL3促进食管癌细胞的增殖能力为了进一步明确METTL3对食管癌细胞的影响,分别建立稳定低、高表达METTL3（METTL3-KD、METTL3-OV）的食管癌细胞株 Eca-109、KY-SE150;Westernblot 结果显示:在 Eca-109、KY-SE150 细胞株中,METTL3-KD 组与相对应的NC组相比,METTL3蛋白表达显著降低（P＜0.05）,两个靶点中我们又采用了 METTL3-KD-2组的靶点序列进行后续实验;而METTL3-OV组与相对应的NC组相比,METTL3蛋白表达显著增高（P＜0.05）,证明转染成功。接下来的CCK-8实验结果显示:与对应的NC组相比,METTL3-KD组Eca-109、KY-SE150细胞的增殖能力均显著降低;通过平板克隆实验发现,与对应的NC组相比,METTL3-KD组Eca-109、KY-SE150细胞的克隆形成数目明显减少。CCK-8实验结果也显示:与相对应的NC组相比,METTL3-OV组Eca-109、KY-SE150细胞的增殖能力均显著升高;通过平板克隆实验亦发现,与对应的NC组相比,METTL3-OV组Eca-109、KY-SE150细胞的克隆形成数目明显增多,且差异均具有统计学意义（P＜0.05）。4.METTL3抑制食管癌细胞的凋亡通过流式细胞术检测干扰或过表达METTL3后,Eca-109、KY-SE150食管癌细胞株中发生凋亡的细胞比例。实验发现,与其对照组（NC）相比,干扰METTL3表达（METTL3-KD）后,Eca-109、KY-SE150细胞凋亡的比例均明显升高;反之,与其对照组（NC）相比,过表达METTL3（METTL3-OV）后,Eca-109、KY-SE150细胞凋亡的比例均明显降低,差异具有统计学意义（P＜0.05）。5.METTL3促进食管癌细胞的侵袭和迁移众所周知,肿瘤细胞的侵袭和迁移将导致肿瘤的转移和复发。在Transwell迁移及侵袭实验中:与NC组相比,METTL3-KD组的Eca-109和KY-SE150细胞穿过多孔滤膜进入Transwell下室的细胞减少;而在划痕实验中,与其对应的NC组相比,METTL3-KD组的Eca-109和KY-SE150细胞在划痕中迁移的速度变慢,差异均有统计学意义。相反,与NC组相比,METTL3-OV组的Eca-109和KY-SE150细胞穿过多孔滤膜进入Transwell下室的细胞明显增多;而在划痕实验中,与其对应的NC组相比,METTL3-OV组的Eca-109和KY-SE150细胞在划痕中迁移的速度变快,差异均具有统计学意义（P＜0.05）。6.METTL3促进食管癌细胞体内成瘤构建METTL3干扰稳定细胞株Eca-109-shMETTL3及对照组Eca-109-NC后,皮下移植瘤模型结果显示:种植Eca-109-shMETTL3细胞组,肿瘤体积显著小于Eca-109-NC细胞组;对肿瘤重量影响的结果同样如此,且差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论:1.在正常食管细胞株和食管癌细胞株中METTL3均有表达,且相较于正常食管细胞株,其在食管癌细胞株中的表达更高。2.相较于癌旁正常食管黏膜组织,METTL3在食管癌组织细胞中的表达更高。3.体外实验证实METTL3可促进食管癌细胞增殖、侵袭及迁移,并对食管癌细胞产生抗凋亡的作用。4.体内动物实验证实METTL3可增强食管癌细胞Eca-109体内成瘤的能力。第二部分METTL3影响食管鳞癌凋亡、增殖、迁移的机制研究研究目的通过检测相关通路蛋白表达的变化,进一步探讨METTL3对食管癌细胞发挥作用的分子机制,并在过表达METTL3的食管癌细胞中加用PI3K和磷酸化mTOR（p-mTOR）的双重抑制剂,进而观察其对METTL3-OV组食管癌细胞株增殖、迁移等的影响;通过对AKT信号通路上游分子EGFR进行干扰,观察其对过表达METTL3的食管癌细胞株增殖、迁移等恶性生物学行为的影响,探讨METTL3促进食管肿瘤进展可能的分子机制,为研发新的食管癌治疗药物提供理论基础。研究方法1.通过Western blot检测干扰和过表达METTL3后Eca-109和KY-SE150食管癌细胞株中相关凋亡蛋白以及Wnt3/β-catenin信号通路、上皮间质转化（EMT）及AKT信号通路上多个关键蛋白的表达变化,并进一步在体内成瘤组织中验证。2.将PI3K和磷酸化mTOR（p-mTOR）的双重抑制剂—BEZ235作用于过表达METTL3的Eca-109、KY-SE150食管癌细胞株;首先,通过Western blot检测过表达 METTL3 后 Eca-109、KY-SE150 食管癌细胞株中 AKT、p-AKT 和 METTL3的表达变化;然后,通过CCK-8法检测BEZ235对过表达METTL3后的Eca-109、KY-SE150食管癌细胞株增殖的影响;最后,通过划痕实验测定BEZ235对过表达METTL3后的Eca-109、KY-SE150食管癌细胞株迁移率的改变。3.既往研究发现,METTL3可以增强EGFR的翻译,且EGFR在食管癌中高表达,我们推测METTL3是通过增加EGFR表达进而激活下游的AKT信号通路来促进食管癌的进展。因此,我们首先通过Western blot检测METTL3的差异表达对EGFR表达的影响,通过在过表达METTL3食管癌细胞株中干扰EGFR表达,Western blot进一步检测干扰EGFR表达后AKT、p-AKT蛋白的表达变化,并观察其对食管癌细胞增殖、迁移等的影响。研究结果1.METTL3对食管癌细胞的抗凋亡作用通过抑制线粒体凋亡途径实现进一步行Western blot检测,结果显示,与其对应的NC组相比,干扰METTL3表达组的Eca-109、KY-SE150细胞中的促凋亡蛋白Bax,Cleaved-caspase3和Cleaved-caspase9表达增高,而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达下降;反之,与其对应的NC组相比,过表达METTL3组的Eca-109、KY-SE150细胞中促凋亡蛋白Bax,Cleaved-caspase3和Cleaved-caspase9表达降低,而抗凋亡蛋白Bcl-2表达增高,差异具有统计学意义（P＜0.05）。说明METTL3对食管癌细胞的抗凋亡作用通过抑制线粒体凋亡途径实现。2.METTL3通过激活Wnt3/β-catenin信号通路,并促进EMT,从而对食管癌细胞发挥促迁移的能力为了进一步探讨METTL3对人食管癌细胞发挥促迁移能力的具体分子机制,我们通过检测干扰或过表达METTL3后Wnt3/β-catenin信号通路关键蛋白、EMT主要代表蛋白表达的变化,并在体内成瘤组织中进一步验证,来阐述Wnt3/β-catenin信号通路以及EMT与METTL3生物学功能的关系。Western blot检测结果显示:METTL3-KD组较NC组食管癌细胞中Wnt3和β-catenin蛋白表达明显下降,而E-cadherin表达明显增加,N-cadherin和Vimentin的表达均明显降低;相反,与其对应的NC组相比,METTL3-OV组食管癌细胞中 E-cadherin 表达明显下降,而 Wnt3、β-catenin、N-cadherin 及 Vimentin 的表达均明显增加,差异均具有统计学意义（P＜0.05）。体外实验提示,Wnt3/β-catenin信号通路及EMT均参与METTL3对食管癌细胞的促迁移能力的调控。同样,体内成瘤组织中,Eca-109-shMETTL3 组较对照组 Eca-109-NC 的 Wnt3、β-catenin表达均明显降低,体内实验同样提示METTL3可活化Wnt3/β-catenin信号通路。3.METTL3通过活化AKT信号通路发挥对食管癌细胞促增殖和促迁移的作用为了明确METTL3促进人食管癌细胞的增殖和迁移能力的具体机制,我们通过检测METTL3的差异表达对AKT信号通路中主要蛋白表达的影响,来探讨AKT信号通路与METTL3生物学作用的关系。Western blot检测结果显示:与其对应的NC组相比,METTL3-KD组食管癌细胞中磷酸化AKT（p-AKT）和磷酸化mTOR（p-mTOR）的表达水平降低,下游通路中p70和Cyclin D1蛋白的表达也下降;相反,与其对应的NC组相比,METTL3-OV组食管癌细胞中p-AKT和p-mTOR的表达水平升高,致使p70和Cyclin D1蛋白表达上调,差异均具有统计学意义（P＜0.05）。未发生磷酸化的AKT和mTOR在METTL3-KD组和METTL3-OV组均无明显变化。体外实验提示,METTL3可激活AKT信号通路,进而对食管癌细胞发挥促癌作用。同样,体内成瘤的组织中,Eca-109-shMETTL3组中p-AKT表达量较对照组Eca-109-NC明显降低,而AKT表达变化不大,体内实验同样提示METTL3能活化AKT信号通路。为了进一步确认METTL3通过活化AKT信号通路来发挥对食管癌细胞促增殖和促迁移的作用,我们使用了 BEZ235（PI3K和p-mTOR的双重抑制剂）来进行后续的实验。Western blot检测结果显示:BEZ235作用于过表达METTL3的 Eca-109、KY-SE150 食管癌细胞后（METTL3-OV+BEZ235）,与 METTL3-OV组相比,AKT和METTL3的表达均无明显变化,而p-AKT的表达则被明显抑制,提示,BEZ235可抑制METTL3对AKT的激活。接下来的CCK-8检测结果显示:与METTL3-OV组细胞相比,METTL3-OV+BEZ235组细胞的增殖能力均有明显下降,提示,BEZ235可减弱METTL3-OV对食管癌细胞的促增殖作用。划痕实验检测发现,与METTL3-OV组细胞相比,METTL3-OV+BEZ235组细胞的迁移速率明显下降,提示,BEZ235可减弱METTL3-OV对食管癌细胞的促迁移作用。差异均具有统计学意义（P＜0.05）。4.EGFR是METTL3介导的EC增殖侵袭作用的关键因子既往研究发现,METTL3可以增强EGFR的翻译,且通常EGFR在食管癌中高表达,我们推测METTL3是通过增加EGFR表达进而激活下游的AKT信号通路,促进食管癌的增殖。我们首先通过Western blot验证METTL3的差异表达对EGFR表达变化的影响。Western blot检测结果显示:与OV-NC组相比,OV-METTL3组细胞的EGFR表达是明显升高的,与sh-NC组相比,sh-METTL3组的EGFR表达是明显降低的。而且,与过表达METTL3组（OV-METTL3+sh-NC）相比,同时转染过表达METTL3和干扰EGFR（OV-METTL3+sh-EGFR）组细胞的EGFR和p-AKT表达下降,而AKT表达无明显变化,且细胞增殖能力降低,在划痕中迁移的速度变慢,提示METTL3通过增加EGFR表达,进而活化AKT信号通路,进一步对食管癌细胞发挥促增殖和促迁移的作用。差异均具有统计学意义（P＜0.05）。结论1.METTL3对食管癌细胞的抗凋亡作用通过抑制线粒体凋亡途径实现。2.METTL3通过激活Wnt3/β-catenin通路及EMT,从而对食管癌细胞发挥促迁移的能力。3.METTL3通过增加EGFR表达,并活化AKT信号通路,对食管癌细胞发挥促增殖和促迁移作用,从而对食管癌发挥癌基因的作用,促进肿瘤进展。