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肺癌是一种基因病,随着现代分子肿瘤学的发展,肺癌的基因治疗成为继手术、放、化疗后最具前景的治疗手段。由于肿瘤发生的复杂性及患者的异质性,往往要将基因治疗与其它疗法相结合才能收到满意的疗效。本课题首次将wtp53基因转染与光动力疗法联合起来用于肺癌的治疗,探讨两种疗法对人肺腺癌细胞系A549增殖、凋亡及肿瘤血管生成的各自作用及相互影响。具体实验分体外、体内两部分,共分以下六组:A549细胞(A)、A549/pCDNA3.1-neo细胞(B)、 A549/pCDNA3.1-wtp53细胞(C)、 A549细胞+PDT(D)、 A549/pCDNA3.1-neo细胞+PDT(E)、 A549/ pCDNA3.1-wtp53细胞+PDT(F)。第一部分 体外实验目的:研究wtp53基因转染联合PDT对体外培养的人肺腺癌细胞系A549细胞增殖周期及凋亡的作用,并在此基础上初步探讨其对肿瘤血管生成的影响。方法:将pCDNA3.1-wtp53质粒和空载体pCDNA3.1-neo质粒,通过阳离子脂质体Lipofectamin 2000分别转染A549细胞,以sqRT-PCR和Western blot分析外源基因的整合与表达。PDT(HPD10ug/ml、激光剂量10J/cm2)后24h进入实验。将六组细胞连续培养7天,观察细胞生长曲线。流式细胞术测定细胞周期及凋亡率、琼脂糖电泳观察DNA Ladder、TUNEL标记法检测细胞AI。用sqRT-PCR分析VEGF mRNA表达,ELISA法测定细胞培养上清中VEGF蛋白的水平。结果:细胞生长曲线显示A组与B组细胞均呈对数生长, C、D、E组细胞生长有所减慢,潜伏期延长,联合治疗的F组细胞生长抑制显著,7天后细胞数仅增加了4.5×104。细胞周期分析结果表明:C、D、E、F四组均呈G0/G1期生长停顿,四组中以F组G0/G1期细胞所占比例最高;此外,流式细胞术还证实wtp53基因转染及PDT均可使细胞发生不同程度的凋亡,仍以F组凋亡率最高。琼脂糖电泳结果表明,除A、B两组未见小片段DNA梯形条带外,其余四组均可见特征性的大小为200bp不同倍数的DNA片段梯形条带,以F组梯形条带最多也最为清晰。TUNEL染色证实A、B组以紫蓝<WP=5>色正常细胞为主,其余四组均可见棕黄色凋亡细胞,F组AI最高。sqRT-PCR及ELISA结果均说明wtp53基因转染后VEGF表达明显降低(与A组比较P<0.01),经PDT后三组VEGF表达增加不明显(与未联合治疗组比较P>0.05)。结论:wtp53基因转染及PDT均可使A549细胞发生G0/G1期生长停顿并诱导其凋亡,二者联合使用可发挥协同作用,转染wtp53基因后的A549细胞对PDT的敏感性增强。此外,wtp53基因转染还可通过下调VEGF水平来抑制肿瘤血管生成,并在一定程度上抑制PDT后 VEGF表达的轻度增加。