【摘 要】
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目的:慢性肾脏病（Chronic kidney disease,CKD）在我国发病率高达10.8%,位居全球全因死亡率的第12位,肾间质纤维化（Renal interstitial fibrosis,RIF）是各种病因导致的CKD共同病理特征。但目前尚无有效治疗或逆转RIF的方法。课题组报道Locked Nucleic Acid（LNA）-anti-miR-150可缓解叶酸（Folic acid,
【基金项目】
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国家自然科学基金（81770698,82170740,82100743）； 辽宁省重点研发指导计划（2019JH8/10300009）； 辽宁省兴辽英才计划（XLYC2002081）； 辽宁省攀登学者（2013222）；
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目的:慢性肾脏病（Chronic kidney disease,CKD）在我国发病率高达10.8%,位居全球全因死亡率的第12位,肾间质纤维化（Renal interstitial fibrosis,RIF）是各种病因导致的CKD共同病理特征。但目前尚无有效治疗或逆转RIF的方法。课题组报道Locked Nucleic Acid（LNA）-anti-miR-150可缓解叶酸（Folic acid,FA）诱导的小鼠肾脏纤维化,并且在人肾小管上皮细胞（Human Kidney 2,HK-2）与巨噬细胞共培养中证实调控细胞因子信号转导抑制因子1（Suppressor of cytokine signal 1,SOCS1）/两面神激酶（Janus kinase,JAK）/信号传导及转录激活因子（Signal transducer and activators of transcription,STAT）通路可能参与肾脏保护作用。已知SOCS1/JAK/STAT通路可促进巨噬细胞向M1表型极化且巨噬细胞是导致肾间质纤维化的关键因素。但LNA-anti-miR-150是否在肾间质纤维化体内实验中通过SOCS1/JAK/STAT进而影响巨噬细胞向M1表型极化尚未见报道。为回答上述问题,本研究在叶酸诱导RIF小鼠中探明LNA-anti-miR-150是否影响SOCS1/JAK/STAT通路进而调控巨噬细胞的M1极化及其作用机制。研究方法:将24只12周龄CD1雄鼠随机分成四组,分别为1)正常对照（Normal control,NC）组,2)FA注射组,3)FA注射+Scrambled LNA组,4)FA注射+LNA-anti-miR-150组。腹腔一次性注射250 mg/kg的叶酸溶液诱导CD1小鼠2天发生急性肾损伤（acute kidney injury,AKI）,30天发生肾间质纤维化（组2）。12只小鼠于叶酸注射后第2天时给予2mg/kg Scrambled LNA（组3）或LNA-anti-miR-150（组4）皮下注射,每周2次,共注射4周。对照组注射溶解叶酸的溶剂（组1）。叶酸注射后2天时收集小鼠静脉血,检测肌酐（Serum creatinine,Scr）、尿素氮（Blood urea nitrogen,BUN）水平,确认小鼠发生了急性肾损伤。实验终点及叶酸注射后30天收集小鼠静脉血进行Scr、BUN测定反映肾功能水平;肾脏灌流后收集肾组织制作石蜡组织块,冰冻肾组织用于提取蛋白质进行Western blotting分析,提取肾组织总RNA进行RT-q PCR检测。石蜡切片通过糖原染色（Periodic Acid-Schiff staining,PAS）和MASSON染色评估肾脏损伤和纤维化程度;RT-q PCR检测miR-150的表达水平;Western blotting和免疫组化染色检测SOCS1/JAK1/STAT1通路相关指标包括SOCS1,JAK1,p-JAK1,STAT1,p-STAT1,促纤维化相关蛋白平滑肌肌动蛋白（α-Smooth muscle actin,α-SMA）和纤维连接蛋白（Fibronectin,FN）,巨噬细胞标志物CD68和M1巨噬细胞标志物CD11c的蛋白表达水平。结果:一次性腹腔注射叶酸2天后小鼠血清Scr和BUN水平显著升高,证实发生了急性肾损伤,随后开始逐渐下降于2周降至正常水平,此时间窗相当于临床表现正常但是肾组织尚进行性向肾间质纤维化进展。4周后PAS和MASSON染色可见肾组织中有大量炎性细胞浸润和沿着髓放线分布的片状纤维化发生。进一步Western blotting和免疫组化染色显示促纤维化的蛋白α-SMA和FN的表达升高。更为重要的是RT-q PCR结果显示叶酸诱导的肾间质纤维化小鼠模型肾组织中miR-150的表达显著升高。而与FA+scrambled LNA组比较,FA+LNA-anti-miR-150组小鼠miR-150的表达显著降低。光镜下PAS和MASSON染色可观察到肾组织内炎性细胞浸润程度,纤维化程度获得缓解,并被半定量分析所证实。而且促纤维化蛋白α-SMA和FN的表达也明显减少。进一步我们探讨了LNA-anti-miR-150减轻炎症细胞浸润和纤维化的机制,发现在叶酸诱导的肾间质纤维化小鼠肾组织中的SOCS1蛋白表达下调,p-JAK1和p-STAT1的蛋白表达上调,巨噬细胞的标志物CD68蛋白表达升高,并且M1标志物CD11c蛋白表达也升高;而应用LNAanti-miR-150后,与FA+scrambled LNA组相比,上述SOCS1/JAK/STAT通路蛋白与总巨噬细胞及M1巨噬细胞的变化获得逆转。结论:在叶酸诱导的肾间质纤维化小鼠中,LNA-anti-miR-150可能是通过SOCS1/JAK1/STAT1通路减少M1巨噬细胞极化从而发挥抗纤维化作用。
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