研究背景:静脉血栓是血管外科临床常见的一种疾病。静脉血栓以下肢深静脉血栓形成多见。目前国内外静脉血栓的治疗策略主要是抗凝、祛聚和溶栓等非手术措施。抗凝和祛聚治疗的目的在于防止新的血栓形成,但长期应用抗凝和祛聚药物有导致严重出血的风险。而溶栓治疗虽然能溶解已形成的血栓,但溶栓药物只能作用于血栓的表面,很难进入血栓内部发挥作用,因而直接溶栓治疗还没有成为一种标准的治疗策略。静脉血栓常引起血栓后综合症(postthrombotic syndrome),其治疗效果欠佳且费用昂贵。静脉血栓的溶解和吸收主要是依赖于机体自身的慢性自然溶解机制。包括纤维蛋白溶酶介导的纤维蛋白溶解和蛋白水解酶介导的胶质崩解等。新生肉芽组织长入血栓并取代血栓的过程即是血栓的机化过程。在血栓形成后的1-2天,单核细胞、巨噬细胞、成纤维细胞和血管内皮细胞等在趋化因子的作用下进入血栓内部,随着肉芽组织的增生,新生血管逐渐形成,血流可通过这些管腔而实现静脉血管的再通。如果机体对血栓的溶解和吸收彻底,血管可完全再通,否则形成边缘毛燥、管径粗细不一的再通静脉。并伴随着静脉瓣膜的破坏,形成一个管腔通畅但瓣膜关闭不全的静脉系统,造成静脉血液的逆流,最终引起血栓后综合症。因而增加微血管的生成和促进血栓的机化可减轻静脉瓣膜的损害和再通静脉的阻塞,从而预防血栓后综合症的发生。最近研究发现,单核细胞在静脉血栓的溶解和吸收中发挥重要的作用。单核细胞能够释放和介导血管平滑肌细胞前血管生成因子的释放。在体内和体外实验中均发现,血栓中的新生血管主要出现在单核-巨噬细胞聚集的区域。体外实验证实,在静脉血栓中注入单核-巨噬细胞可以促进其溶解。更新的研究显示,通过骨髓动员,各种来源于骨髓的干细胞和祖细胞参与了静脉血栓的溶解和吸收。早期的研究已经揭示趋化因子在深静脉血栓的溶解中发挥极其重要的作用。趋化因子是体内广泛存在的一类肽类炎症介质。它们扮演着趋化白细胞到达作用靶位和激活白细胞特有功能的角色。趋化因子主要有四个亚族。其中与深静脉血栓溶解关系最密切的是CC类和CXC类趋化因子。在实验模型中发现,加入外源性的MCP-1(一种CC类趋化因子)和IL-8(一种CXC类趋化因子)均能加速血栓的溶解。趋化因子与其特异性受体一起构成细胞信号转导通路,从而发挥其对靶细胞的趋化、激活等作用。CC类趋化因子主要趋化和激活单核细胞。它的作用需要通过其相应的受体CCR来实现。MCP-1与其特异性受体CCR2构成MCP-1/CCR2信号转导通路参与单核细胞的迁移和游走,对于单核细胞的募集极为重要。有研究发现,CCR2基因敲除可抑制单核细胞在血栓中的聚集,MMP-2和MMP-9活性降低,血栓中胶原含量增加,血栓的体积增大,其溶解受到明显抑制。因此我们设想,若能主动增强静脉血栓中单核细胞的功能,一定有助于促进静脉血栓的溶解,实现血管的早期再通,减少血栓后综合症的发生。本研究拟探讨通过运用细胞因子rhGM-CSF来增加单核细胞CCR2的表达,从而促进其聚集,为进一步研究其在静脉血栓溶解中的机制打下一定的理论基础和实验依据。研究方法:1细胞实验人单核细胞株THP-1培养于含10%胎牛血清、2.0mmol/L谷氨酰胺、10.0mmol/L HEPES、1.0 mmol/L丙酮酸钠、5.0×10~-5mol/Lβ-巯基乙醇、1.0×10~5U/L青霉素、100mg/L链霉素的RPMI-1640培养液中。培养液中加入终浓度为0、40、80、160ng/ml的rhGM-CSF。1×10~5个细胞接种于24孔培养板,6×10~5个细胞接种于100ml培养瓶。ELISA法检测培养液中MCP-1的水平,操作按人MCP-1 ELISA Kit说明书进行。培养的THP-1细胞总RNA提取按柱式小量细胞总RNA抽提试剂盒的说明步骤进行。RT-PCR扩增参照TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0试剂盒操作说明书进行。PCR产物用2%琼脂糖进行凝胶电泳,Goldview染色。凝胶成像分析系统进行检测。按照细胞总蛋白提取试剂盒说明书提取THP-1细胞总蛋白。等量蛋白加样于40%的聚丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺凝胶后120V电压下电泳,电转膜至PVDF膜上。TBST封闭过夜。1:400兔抗人CCR2抗体温育1.5 h。洗膜,1:4,000 HRP结合的羊抗兔IgG抗体温育2h。内参照GAPDH的检测同上述方法。结果以化学发光法显色后进行OD值测定。2统计分析采用SPSS11.5统计软件对数据资料进行统计分析。所有数据根据具体资料采用F检验、Dunnett检验等检验方法。以P值﹤0.05为差异有显著性。结果:1 THP-1细胞生长情况THP-1细胞培养24和48h后计数池计数。结果显示rhGM-CSF对THP-1细胞的生长没有促进或抑制作用。2 MCP-1的水平培养24h和48h后,THP-1细胞培养液中MCP-1水平在不同浓度组间均没有显著性差异。显示rhGM-CSF对THP-1细胞分泌MCP-1没有促进或抑制作用。3 CCR2 mRNA的表达不同浓度组中,80ng/ml rhGM-CSF浓度组对THP-1细胞CCR2 mRNA的表达促进作用最强。THP-1细胞在含80ng/ml rhGM-CSF的培养液中培养36和48h后,其CCR2mRNA的表达稳定增强。4 CCR2蛋白的表达不同浓度组中,80ng/ml rhGM-CSF浓度组对THP-1细胞CCR2蛋白的表达促进作用最强。THP-1细胞在含80ng/ml rhGM-CSF的培养液中培养36和48h后,其CCR2蛋白的表达稳定增强。结论:1. rhGM-CSF对THP-1细胞分泌MCP-1无抑制或促进作用。2. rhGM-CSF可以增加单核细胞趋化因子受体CCR2的表达。