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黑米富含花色苷类成分,对氧化应激引起的癌症、心血管疾病、糖尿病等慢性疾病具有预防作用,充分挖掘黑米花色苷的功能潜力和作用机制可为预防多种疾病提供理论依据。过量光暴露会造成视网膜光氧化损伤,引发不容忽视的公共健康问题。研究表明,摄入花色苷有助于维持视力健康,保护机制涉及缓解氧化应激、炎症和凋亡通路。但目前关于花色苷是否通过调控内质网应激发挥保护视力的报道还不多见,对其调控机制的探讨也不足。本研究以黑米为原料,按现行标准提取并测定多酚和花色苷含量,用XAD-7大孔树脂和Sephadex LH-20联合分离纯化;以N-亚视黄基-N-视黄基-乙醇胺（N-retinylidene-N-retinyl-ethanolamine,A2E）和蓝光照射视网膜色素上皮（Retinal pigmented epithelium,RPE）细胞模拟人眼在长时间或过强的电脑或手机蓝光暴露下的氧化损伤过程,探讨黑米花色苷及其主要成分矢车菊素-3-葡萄糖苷（Cyanidin-3-glucoside,C3G）对RPE细胞屏障功能的保护作用及其保护机制是否涉及内质网应激关键通路。主要研究内容及结果如下:1.黑米花色苷的提取纯化及含量测定。选取黑珍珠、洋县3号、黑籼粘、黑香糯,以酸化甲醇超声法提取黑米多酚和花色苷,按行业标准（T/AHFIA 005-2018和NY/T 3164-2017）测定样品多酚和花色苷含量。结果表明:黑米总多酚和花色苷含量分别在0.8-1.8 mg GAE/g和0.08-0.87 mg C3G/g。紫外可见光谱扫描,黑米醇提物符合花色苷类典型光谱特性,高效液相色谱分析醇提物中C3G占花色苷总量的80%。黑籼粘的多酚和花色苷含量最高,以黑籼粘为原料进一步纯化花色苷,经XAD-7树脂纯化所得黑米粗提物中C3G含量为109.14 mg C3G/g,Sephadex LH-20葡聚糖凝胶再次纯化所得黑米花色苷提取物中 C3G 含量为 342.89 mg C3G/g。2.黑米花色苷对RPE细胞屏障功能的保护作用。建立A2E+蓝光诱导的RPE细胞损伤模型,结果表明:以25 μM A2E处理RPE细胞3 d,蓝光15000 lux照射细胞40 min,细胞存活率约为60%,基于该细胞模型研究黑米花色苷对RPE细胞及其屏障功能的保护作用及机制。CCK8结果表明:黑米多酚和花色苷呈剂量依赖性提高细胞存活率,150 μg/mL（10.61 μg/mL C3G）黑米多酚对光损伤RPE细胞具有显著（P＜0.05）保护作用;15 μg/mL（5.14 μg/mL C3G）黑米花色苷对光损伤RPE细胞具有显著（P＜0.05）保护效果。35 μg/mL（12.00 μg/mL C3G）黑米花色苷组与C3G（11.22 μg/mL）对照组保护效果无显著性差异（P＞0.05）,即黑米花色苷对RPE细胞存活率的提高作用可能是其主要花色苷C3G发挥的作用。DCFH-DA荧光探针法测定细胞ROS水平,结果表明:黑米花色苷可呈剂量依赖性下调ROS水平,15μg/mL黑米花色苷可极显著（P＜0.01）降低ROS含量。酶联免疫试剂盒测定MDA含量和抗氧化酶（SOD和GSH-Px）活力,结果表明:15 μg/mL黑米花色苷处理显著降低MDA含量（P＜0.05）,极显著提高了 SOD和GSH-Px酶活力（P＜0.01）。以上结果表明黑米花色苷从缓解氧化应激方面发挥保护RPE细胞的作用。利用连续培养6 d、跨膜电阻值稳定于40 Ω.cm2以上的RPE细胞进行造模及黑米花色苷处理,结果表明:光照后1 d,模型组RPE细胞跨膜电阻值降至20.08 Ω.cm2,较空白组下降了43.15%（P＜0.05）,光照后1d和2d,15、35μg/mL黑米花色苷可显著（P＜0.05）提高跨膜电阻值,维持细胞屏障功能。RPE细胞屏障主要由RPE和细胞间紧密连接组成,Western blot检测紧密连接蛋白表达,结果表明:黑米花色苷可显著（P＜0.05）上调ZO-1、Occludin和Claudin-5蛋白表达。以上结果表明黑米花色苷可提高RPE细胞存活率、上调紧密连接蛋白表达、增强细胞跨膜电阻值,从而发挥屏障功能保护作用。3.黑米花色苷主要成分C3G通过调控内质网应激增强RPE细胞屏障功能。细胞活性及蛋白表达检测结果表明:C3G可显著提高RPE细胞存活率、提高跨膜电阻值并增加紧密连接蛋白（ZO-1和Claudin-5）表达（P＜0.05）。10 μM C3G（4.49 μg/mL C3G）与 15μg/mL 黑米花色苷（5.14 μg/mL C3G）在提高RPE细胞存活率、提高跨膜电阻值并增加紧密连接蛋白（ZO-1和Claudin-5）表达上无显著性差异（P＞0.05）,以上结果表明C3G是黑米花色苷增强RPE细胞屏障功能的主要活性成分。细胞凋亡检测结果表明:模型组细胞凋亡率（89.65%）显著升高,10和25μM C3G可显著（P＜0.05）抑制细胞凋亡（凋亡率分别下降至18.92%和6.31%）。内质网应激通路相关蛋白和mRNA表达结果表明:光损伤模型组BiP蛋白和mRNA表达量显著升高（P＜0.05）,即A2E和蓝光照射可诱导RPE细胞发生内质网应激,C3G处理可显著（P＜0.05）缓解BiP蛋白和mRNA表达,表明C3G对内质网应激具有调控作用。同时,内质网应激可介导PERK-eIF2α-ATF4-CHOP途径诱导细胞凋亡,C3G可显著（P＜0.05）下调与凋亡相关的ATF4和CHOP蛋白和mRNA表达。IRE1α-XBP1s途径的激活可促进细胞存活,C3G干预可提高p-IRE1α和XBP1s蛋白表达,但与模型组无显著性差异（P＞0.05）,进一步利用IRE1α抑制剂（KIRA8）进行验证,表明C3G可通过调控内质网应激（抑制PERK-eIF2α-ATF4-CHOP通路）增强RPE细胞屏障功能。