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研究背景：脂肪间充质干细胞是一种在脂肪组织中分离出来的多能干细胞,在特定的诱导条件下,可以向脂肪、骨、软骨等细胞类型分化。由于脂肪间充质干细胞成软骨分化能力的证实,其作为软骨工程种子细胞的研究越来越多。实验证实,脂肪间充质干细胞在三维培养环境中高密度培养可以成软骨诱导,但在单层培养诱导时无软骨细胞生成,其中三维培养方法有微滴法,微团法。有文献报道,成体软骨细胞单层高密度培养可以形成软骨细胞膜片样结构,在此基础上,设想利用脂肪间充质干细胞成软骨细胞诱导后的细胞,再做单层高密度培养,观察形成软骨膜片的可行性,并进一步观察形成质韧软骨组织的可行性。探索脂肪间充质干细胞成软骨诱导的新方法。实验目的：将大鼠脂肪间充质干细胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)在藻酸盐凝胶中高密度培养成软骨细胞诱导后,将细胞自凝胶中释放单层高密度培养,探索脂肪间充质干细胞成软骨细胞诱导后的细胞形成软骨组织的可行性。实验方法：取健康SD大鼠双侧腹股沟脂肪组织,用0.1%Ⅰ型胶原酶将脂肪组织消化为单细胞悬液后离心,得到脂肪间充质干细胞原代培养,观察细胞形态。细胞增殖达到融合时,用0.25%胰蛋白酶消化传代后用流式细胞技术检测间充质干细胞表面标志CD90、CD44的表达进行细胞鉴定。将第6代脂肪间充质干细胞以5×106/ml密度重悬于藻酸钙凝胶中,形成脂肪间充质干细胞-藻酸盐微珠,用含有软骨诱导细胞因子TGF-β1(transforming growth factor-β1)、胰岛素转铁蛋白硒(Insulin-Transferrin-Selenium,ITS)、维生素C的成软骨诱导培养基成软骨细胞诱导培养2周。2周后将凝胶吹散释放出成软骨诱导后的细胞,将得到的细胞进行免疫组化实验,检测大鼠软骨特异性Ⅱ型胶原蛋白的表达,以鉴定软骨组织的生成。将成软骨诱导后的细胞单层高密度培养于培养皿中,继续以软骨诱导培养基诱导培养2周,观察细胞的生长特点及是否有新生组织形成。探索脂肪间充质干细胞在藻酸钙中成软骨诱导后,单层高密度培养形成软骨组织的可行性。实验结果：大鼠脂肪间充质干细胞原代及传代后呈梭形生长,传代后的细胞呈规则排列漩涡状生长。第6代次细胞形态仍无明显改变,细胞传代后细胞特性保持较为稳定。大鼠脂肪间充质干细胞的表面标志CD90、CD44阳性,说明其为间充质干细胞来源。脂肪间充质干细胞-藻酸盐微珠成软骨诱导2周后,释放出的细胞行细胞免疫组织化学检测软骨特异性Ⅱ型胶原蛋白的表达,结果呈阳性。经过成软骨诱导后的细胞高密度单层培养,在软骨诱导培养基作用下细胞逐渐聚集形成具有三维形态的软骨组织。结论：在藻酸盐凝胶中高密度培养大鼠脂肪间充质干细胞成软骨诱导,再利用凝胶释放的细胞培养形成软骨组织可以作为软骨组织构建的新方法。