目的心肌梗死后局部组织缺血缺氧,导致移植干细胞存活和分化能力降低。因此,提高移植干细胞的存活和分化效率是目前急待解决的问题。本研究通过制备纤维蛋白胶(FG)以及设计和合成新型自聚肽,使自聚肽在生理状态下自组装形成纳米纤维(SPNF),探讨FG和SPNF对MCSC移植治疗心肌梗死的作用及其机制,为临床应用生物材料承载干细胞移植治疗心肌梗死等缺血性心脏病提供新的措施和实验依据。方法通过单克隆培养技术和c-kit、Sca-1和CD133免疫荧光标记从MMSC中筛选出具有心肌特异分化潜能的MCSC,并利用RT-PCR检测心肌早期转录因子GATA4、Nkx2.5.Mef2C和Tbx5的表达。在体外,用AO/EB染色检测MCSC在FG中的存活和凋亡,用细胞计数法检测MCSC在FG中的增殖,通过损伤和自然迁移实验评价MCSC从FG中的迁出。建立细胞缺血缺氧模型,用AO/EB染色和乳酸脱氢酶(LDH)泄漏法检测FG对MCSC的保护作用。通过对自聚肽RADA16进行功能基修饰,设计和合成新型自聚肽,用原子力显微镜(AFM)和扫描电镜观察自聚肽自组装的效果和形态结构,通过动物在体实验和ELISA检测法评价自聚肽的免疫原性。利用体外实验评价SPNF与MCSC的生物相容性,并通过扫描电镜和透射电镜相结合的方法观察SPNF在体外和体内的降解过程。用细胞计数检测SPNF对MCSC黏附的作用,通过AO/EB染色、LDH泄漏法和Annexin V/PI双标流式细胞分析检测SPNF对MCSC抗缺血缺氧的保护作用。经光镜观察、cTnT免疫细胞化学染色和扫描电镜观察检测SPNF对MCSC向心肌细胞分化的作用。建立雌性大鼠急性心肌梗死模型,30 min后进行细胞移植,评价FG和SPNF承载MCSC移植治疗大鼠心肌梗死的效果。通过扫描电镜观察FG的结构。分别通过扫描电镜和透射电镜观察SPNF的结构。移植后4 w,用M型超声心动图检测细胞移植后的心功能变化。取各组心脏作组织切片,进行Masson染色和CD31免疫组织化学染色,用图像分析系统测量瘢痕面积、胶原纤维比率、梗死区室壁厚度和微血管密度。通过原位荧光杂交和免疫组织化学染色检测Y染色体阳性细胞的cTnT和Cx-43表达,对表达cTnT的Y染色体阳性细胞进行计数。结果从MMSC中筛选出的c-kit/Sca-1/CD133阳性MCSC表达心肌早期转录因子GATA-4、Nkx2.5. Mef2C和Tbx5。在BMP-2的诱导下MCSC能有效地分化为心肌细胞。采用5mg/ml纤维蛋白原制备的FG弹性较高,机械强度较低,有利于MCSC生长。MCSC在FG中保持较高的活力和增殖能力,并且能够从FG中迁出。FG可以保护MCSC抵抗缺血缺氧造成的凋亡和坏死,降低LDH的释放。用高效液相色谱仪测得合成的多肽纯度为96.23%,在AFM和扫描电镜下可见自聚肽自组装形成纳米纤维结构。纳米纤维直径约10 nm,长度为100-300 nm,孔径为5-200 nm。将自聚肽体内注射后血清中未检测到抗多肽抗体的产生。体外研究显示,MCSC能够很好地黏附于SPNF支架上,并充分铺展。培养2 w可见SPNF结构较完整,而培养4 w大部分SPNF已被降解,仅在细胞表面和细胞之间见到少量纳米纤维片段。细胞计数发现,SPNF对MCSC的黏附具有促进作用。AO/EB染色和MTT检测显示,MCSC在SPNF中具有较高的活力,并能够保持良好的增殖能力。经缺血缺氧处理12 h后,在SPNF组,MCSC存活数目较多,凋亡和坏死细胞较少,培养上清液中LDH的水平明显低于MCSC组。在SPNF中培养的MCSC经诱导后2 w,相差显微镜下可见细胞呈短柱状,细胞平行排列,相邻细胞间出现细胞连接,细胞表达cTnT。诱导后4 w,相邻细胞之间细胞连接增多,细胞形成心肌样结构,cTnT的表达明显增强。用FG承载MCSC移植后30 min,扫描电镜下可见FG呈现纤维束或纤维网状结构,分布于宿主心肌细胞之间,移植的细胞黏附于FG纤维上。在细胞移植后4 w,与MCSC和FG单独移植组相比,FG承载MCSC移植组心功能恢复更好、瘢痕面积明显缩小、梗死区室壁厚度增加、梗死区和边缘区微血管密度增大、可见到更多的Y染色体阳性细胞,这些Y染色体阳性细胞大部分同时表达cTnT和Cx-43。用自聚肽承载MCSC移植后30 min,在注射部位可观察到自聚肽已自组装形成约10 nm直径的SPNF。移植的细胞黏附于SPNF网架上。移植后2 w,可见SPNF包绕于移植细胞的周围,结构较完整。移植后4 w,大部分SPNF已被降解,在心肌细胞之间偶尔可见到少量SPNF片段。SPNF承载MCSC移植与MCSC和SPNF单独移植相比,心功能指数明显提高、瘢痕面积显著减小、梗死区室壁厚度明显增加、微血管密度显著增大、Y染色体阳性细胞数明显增多,均具有统计学差异。免疫组织化学染色显示,大部分Y染色体阳性细胞同时表达cTnT和Cx-43,表达Cx-43的Y染色体阳性细胞与宿主心肌细胞形成连接。结论从MMSC中筛选的MCSC表达心肌早期转录因子GATA4、Nkx2.5、Mef2C和Tbx5,具有较高的心肌分化趋向,可作为干细胞移植治疗心肌梗死的良好种子细胞来源。FG作为一种天然生物材料可以为MCSC的生长和向心肌细胞分化提供良好的微环境。在缺血缺氧条件下,FG能够保护MCSC免受缺血缺氧损伤,促进细胞存活和增殖。心肌梗死后用FG承载MCSC移植可通过维持MCSC的存活、迁移,促进MCSC向心肌细胞分化,以及诱导血管新生,促进心肌修复和心功能改善。自聚肽作为一种人工合成的纳米生物材料,具有低免疫原性、很好的生物相容性和可降解性,经功能基修饰的新型自聚肽可黏附细胞和缓释细胞因子。因此,用SPNF承载MCSC移植更有利于移植细胞存活和向心肌细胞分化,从而更有助于心肌修复和心功能改善。FG和SPNF都可作为干细胞移植的载体,有望应用于临床干细胞移植治疗中。而SPNF作为一种可修饰的纳米生物材料,有可能成为一种比较理想的生物材料来源。