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γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是一种可由微生物大量生物合成的氨基酸聚合物,它由D-型或L-型谷氨酸通过γ-酰胺键连接而成。是一种可食用、易降解、无毒害、水溶性的生物高分子材料,其在医药、环保、农业、食品和化妆品行业拥有广阔的应用空间。为了提高微生物发酵生产聚谷氨酸的产量,本文首先筛选得到一株聚谷氨酸高产菌;然后通过外部的优化发酵培养条件和改造菌株自身俩方面来提高γ-聚谷氨酸的产量。经形态学和菌株16srDNA鉴定,本文筛选得到的高产菌株为枯草芽孢杆菌,命名为Bacillus Subtilis jxz-9。通过单因素分析和正交实验法,初步确定发酵的最适培养基和最佳条件为:蔗糖40g/l,蛋白胨 5g/l,L-谷氨酸钠 80g/l,NH4CL5g/l,K2HPO4 7.5g/l,MgS04 0.25g/l;培养温度37℃,摇床转速200r/min,接种量为10%,pH值7.0,培养30h,此时聚谷氨酸的产量最高,可达到28.8g/l。在确定最优发酵培养基基础上,再从菌株自身因素出发,利用基因工程手段,改造菌株,从而提高聚谷氨酸的产量。γ-PGA相对分子质量一般在100KD-1000KD,发酵过程中γ-PGA的产生使发酵液粘度增大,影响发酵液中氧的传递,导致溶氧受到限制。透明颤菌血红蛋白(VHb)是一种血红蛋白。VHb能在低氧条件下,从分子水平提高细胞自身对溶氧的利用能力,满足菌体细胞的呼吸要求,使之适应较低的溶氧水平,促进细胞生长和代谢产物的合成,提高目的产物的产量和收率。本文成功将透明颤菌VGB基因导入B.S jxz-9中,阳性重组子的细菌生物量比原始菌株高了 12.61%,γ-PGA产量也比原始菌株高了 20%。上节是从解决发酵后期溶氧问题,构建工程菌,以提高聚谷氨酸的产量。发酵过程中还存在一个难题,就是对底物谷氨酸的利用问题,研究已发现,对DL-谷氨酸利用率最高,但是由于DL-谷氨酸作为底物成本太高,在应用方面受到限制。本文利用谷氨酸消旋酶的过表达,将底物L-谷氨酸转化为DL-谷氨酸,不仅降低了发酵成本,还提高了聚谷氨酸的产量。要实现工业化大规模生产聚谷氨酸,必须要利用发酵罐进行发酵生产。最后还初步探索了 5L小型发酵罐的发酵条件。本论文主要实验结果如下:筛选到一株聚谷氨酸高产菌。从外界发酵环境和菌株自身俩方面优化发酵条件:首先确定发酵培养基的成分和摇床发酵条件。通过基因工程的方法,将透明颤菌血红蛋白基因vgb插入质粒pBluescript ⅡKS(-),构建重组质粒Pks-vgb,并通过化学感受态法转入枯草杆菌jxz-9中,转化子经过酶切和PCR验证。采用一氧化碳差异色谱法测定转入的血红蛋白基因具有表达活性。在B.S jxz-9发酵生产γ-PGA过程中,发现了 Mn2+对聚谷氨酸中D-谷氨酸和L-谷氨酸的比例有明显的影响,对其机理进行研究,发现Mn2+通过调节谷氨酸消旋酶的活性来改变产物聚谷氨酸的立体化学结构。并探讨了谷氨酸消旋酶对γ-PGA发酵生产的影响。通过构建过表达质粒,将谷氨酸消旋酶基因转入Bacillus Subtilis jxz-9体内,成功表达谷氨酸消旋酶,实验底物谷氨酸的转化,降低了成本,提高了产量。5L发酵罐实验发现,搅拌转速、通风量和pH对菌体生长和γ-PGA均有较大影响。