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目的：以腺相关病毒(recombinant adenoassociated virus，rAAV)介导的血管内皮细胞生长因子165基因载体(vascular endothelial growth factor，VEGF165)转染骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，1．观察对MSCs的生长影响及表达，2．探讨MSCs联合VEGF165基因移植对肢体缺血的治疗效果。
方法：1．利用全骨髓培养法提取培养MSCs，绘制原代及第三代细胞生长曲线，利用免疫组化法检测表面标志物CD34、CD44；利用流式细胞术检测表面标志物CD90。2．rAAV-VEGF165基因转染到MSCs后，利用ELISA及PCR检测VEGF165基因的表达，并绘制生长曲线。3．以近交系大鼠建立骨骼肌缺血模型，实验动物随机分为4组(n=10)。股动脉结扎10d后，PBS组(A组)注射PBS作为阴性对照，细胞组(B组)移植MSCs，联合1组(C组)结扎7d后于缺血区移植转染VEGF165基因的MSCs。联合2组(D组)结扎10d后于缺血区移植转染VEGF165基因的MSCs，移植6周后通过Ⅷ因子染色检测新生血管密度。
结果：1．成功培养出MSCs，免疫组化CD44阳性表达，CD34阴性表达；流式细胞术CD90阳性表达。2．ELISA表明在转染rAAV-VEGF165基因后转染组上清中VFGF165分泌水平明显高于未转染组(P＜0.05)，且5d时达到高峰，此后表达开始下降。PCR：琼脂糖凝胶电泳可见在579bp处见到高亮度条带，未转染组未见到。证明rAAV-VEGF165基因成功转染进MSCs细胞中。转染后的生长曲线及细胞形态较未转染组无明显变化，表明VEGF165基因转染对MSCs生长无明显影响。3．Ⅷ因子染色示D组动物缺血区毛细血管密度明显高于A组和B组(P＜0.01)，较C组亦有一定程度的升高(P＜0.05)。
结论：①MSCs有利于VEGF165基因的稳定表达，可作为VEGF165基因的良好细胞载体；②且MSCs联合VEGF165基因移植效果优于单独移植MSCs，移植最佳时间为术后10天。