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第一部分超重或肥胖患者卵泡液和颗粒细胞内氧化应激、凋亡以及Chemerin/CMKLR1分子水平的检测目的:通过收集接受IVF/ICSI的超重或肥胖女性(超重组)以及BMI在正常范围(对照组)的卵泡液和颗粒细胞检测两组氧化应激、凋亡以及chemerin/CMKLR1分子水平的变化。方法:采用流式细胞术的方法检测超重组和对照组颗粒细胞内活性氧分子(ROS)的水平,RT-PCR检测两组颗粒细胞中抗氧化酶SOD1、SOD2、CAT和Gpx的转录水平;RT-PCR和Western Blot检测两组颗粒细胞的凋亡水平;ELISA检测两组卵泡液的chemerin含量,同时RT-PCR和Western Blot检测两组颗粒细胞chemerin及其受体CMKLR1的表达差异。结果:(1)与对照组相比,超重组的女性颗粒细胞中ROS水平升高,SOD2转录水平明显下调,Gpx转录水平明显上升;(2)与对照组相比,超重组的女性颗粒细胞中促凋亡因子Bax/抗凋亡因子Bcl2的m RNA比例明显上升,活化的caspase-3蛋白水平明显上升;(3)与对照组相比,超重组的女性卵泡液中chemerin水平明显升高,同时颗粒细胞中chemerin和CMKLR1转录水平上升,CMKLR1蛋白水平升高。结论:超重或肥胖女性颗粒细胞氧化应激失衡,ROS和凋亡水平升高;超重或肥胖女性卵泡液中chemerin水平上升,颗粒细胞的chemerin/CMKLR1途径被异常激活。第二部分高脂饮食肥胖(DIO)小鼠卵巢中抗氧化酶、凋亡以及Chemerin/CMKLR1分子水平的检测目的:通过构建DIO小鼠模型观察肥胖对小鼠卵巢和颗粒细胞氧化应激凋亡和chemerin/CMKLR1表达的影响,探讨可能产生这些改变的分子机制。方法:通过给4周龄的雌鼠喂食含60%脂肪的饲料构建DIO小鼠模型(OB组),对照组(CHOW组)小鼠喂食普通饲料,每周称量体重,饮食干预12周后取小鼠血清,卵巢以及分离的颗粒细胞。生化分析检测两组小鼠血清中的血糖、总胆固醇和甘油三酯,ELISA检测小鼠血清AMH;RT-PCR检测两组小鼠卵巢和颗粒细胞中抗氧化酶SOD1、SOD2、CAT和Gpx的转录水平;原位TUNEL染色观察小鼠卵巢切片卵泡凋亡并计算两组小鼠卵巢切片凋亡卵泡数量,RT-PCR和Western Blot检测两组小鼠卵巢及颗粒细胞的凋亡水平;ELISA检测两组小鼠血清chemerin含量,同时RT-PCR和Western Blot检测两组卵巢及颗粒细胞chemerin和CMKLR1的表达差异;免疫组化分析小鼠卵巢组织中p-AKT分布,Western Blot比较两组颗粒细胞中p-AKT的差异。结果:(1)与CHOW组相比,OB组小鼠体重从饮食干预三周后即出现差异,至处死前体重明显增加,血生化分析显示OB组小鼠血清中的血糖、总胆固醇和甘油三酯水平上升,但AMH没有显著差异;(2)与CHOW组相比,OB组小鼠卵巢中CAT和Gpx转录水平上调,颗粒细胞中SOD2转录水平明显下调;(3)小鼠卵巢切片原位TUNEL染色发现凋亡卵泡主要表现为内圈颗粒细胞凋亡和散在的颗粒细胞凋亡灶逐渐发展成整个卵泡颗粒细胞的凋亡和卵母细胞凋亡,与CHOW组相比,OB组小鼠卵巢中凋亡卵泡的数量明显较多,卵巢组织和颗粒细胞中Bax/Bcl2的m RNA比例明显上升,颗粒细胞中活化的caspase-3蛋白水平明显上升;(4)与CHOW组相比,OB组小鼠血清中chemerin水平明显升高,卵巢中chemerin和CMKLR1转录水平上升,chemerin蛋白水平升高,同时OB组小鼠颗粒细胞中CMKLR1的m RNA和蛋白均上调;(5)免疫组化染色发现p-AKT主要在生长中的卵泡的颗粒细胞和卵母细胞中表达,而OB组小鼠颗粒细胞的p-AKT明显低于CHOW组。结论:DIO小鼠卵巢和颗粒细胞氧化应激失衡,凋亡卵泡数量增多,凋亡相关蛋白表达水平升高,卵巢组织和颗粒细胞的chemerin/CMKLR1系统表达上升,这些现象可能与颗粒细胞中AKT信号通路被抑制有关。第三部分Chemerin对原代小鼠颗粒细胞氧化应激、凋亡的影响及机制探索目的:通过体外实验观察chemerin对原代小鼠颗粒细胞氧化应激、凋亡的影响并探索产生这些变化的机制。方法:分离小鼠卵巢颗粒细胞并进行体外培养,分别用不同浓度chemerin用或不用促性腺激素(Gn)干预原代小鼠颗粒细胞不同时间,CCK-8试剂盒检测细胞活性;不同浓度chemerin干预原代小鼠颗粒细胞后原位DCFH-DA标记镜下观察细胞ROS,并用流式细胞术检测ROS水平;不同浓度chemerin干预原代小鼠颗粒细胞后原位TUNEL标记镜下观察细胞凋亡数量,Annexin V/PI标记后流式检测凋亡细胞比例,RT-PCR和Western Blot检测细胞的凋亡水平;不同浓度chemerin干预原代小鼠颗粒细胞Western Blot检测p-AKT、p-AMPK和NF-κB p-p65表达改变,并检测在Gn作用下chemerin对p-AKT的影响;用AKT激动剂sc79激活原代小鼠颗粒细胞AKT信号通路后Western Blot检测chemerin下游p-AKT、p-AMPK和活化的caspase-3的改变;转染si RNA沉默原代小鼠颗粒细胞chemerin受体CMKLR1后用chemerin干预细胞,检测下游信号通路的变化,并通过流式细胞术检测细胞的氧化应激和凋亡水平。结果:(1)细胞活性实验结果显示从48小时起100ng/ml和1000ng/ml chemerin干预的细胞较于ctrl组,细胞的活性出现明显下降,并呈现出浓度依赖性,加入Gn的细胞中也得到类似的结果;(2)低浓度的chemerin即可导致原代小鼠颗粒细胞ROS水平上升;(3)100ng/ml和1000ng/ml chemerin会导致原代小鼠颗粒细胞凋亡比例明显增加,Bax/Bcl2的m RNA比例和活化的caspase-3蛋白水平升高;(4)100ng/ml chemerin和1000ng/ml chemerin使p-AKT蛋白量下降,p-AMPKα升高,低浓度的chemerin即可使NF-κB p-p65升高并在100ng/ml chemerin干预时升高最多,Gn可以明显激活AKT通路,chemerin抑制Gn对AKT通路的激活作用;(5)AKT激活剂处理chemerin处理的细胞,发现p-AKT明显升高,同时活化的caspase-3表达下降;(6)CMKLR1沉默后,chemerin对原代小鼠颗粒细胞下游信号通路的改变被逆转,同时和未沉默组相比,CMKLR1沉默的颗粒细胞用chemerin刺激后凋亡细胞比例明显降低。结论:Chemerin可能通过三条信号通路引起原代小鼠颗粒细胞ROS水平上升和凋亡细胞比例增加,其中p-AKT下调是chemerin引起原代小鼠颗粒细胞凋亡的关键通路,抑制chemerin的受体CMKLR1可以逆转chemerin对原代小鼠颗粒细胞的效应。