人的骨骼一生都处于不断的改建过程中,当受到外力刺激时骨骼会发生适应性的变化,外力刺激可以促进新骨的形成,包括临床常见的牵张成骨、正畸牙齿移动过程中牙槽骨的改建等。正畸牙齿移动过程中,牙齿存在两个主要的受力面,压力面骨质吸收,张力面骨质增生,从而使牙齿移动到目标位置。在这一过程中,成骨细胞发挥了重要作用。临床上,有许多牙周病患者需要通过正畸治疗集中牙齿间隙,为后期修复治疗做准备。由于牙周病患者的牙周支持组织薄弱,因此在矫治过程中矫治力大小的控制尤为重要,机械应力对骨组织的改建具有促进作用,但是炎症状态下,骨骼改建的力学效应更加复杂。有研究发现机械牵张力可通过RhoA/ROCK信号通路调节成骨细胞的分化,但是,炎性环境下,机械牵张力对成骨细胞生长特性以及细胞内RhoA/ROCK信号通路的影响尚不清楚。该实验在实验组前期研究结果的基础上,以1ug/ml Pg-LPS(牙龈卟啉单胞菌来源的脂多糖)刺激小鼠成骨样细胞(MC3T3-E1),模拟建立体外口腔炎性环境,应用Flex-cell 5000应力加载系统给成骨细胞施加8%牵张应力刺激,观察细胞的生长情况,通过RT-PCR、Western blot技术检测Pg-LPS刺激下细胞内RhoA,ROCK与成骨分化基因Runx-2的表达。另外通过抑制RhoA/ROCK信号通路,探讨Pg-LPS刺激下,牵张应力作用于成骨细胞后,RhoA/ROCK信号与成骨分化之间的关系。目的:探讨Pg-LPS刺激下,周期性牵张应力对成骨细胞MC3T3-E1生长特性的影响以及Pg-LPS刺激下,周期性牵张力对细胞内RhoA/ROCK信号的影响;进一步了解Pg-LPS刺激下,牵张应力作用于成骨细胞后,RhoA/ROCK信号与成骨细胞分化作用之间的关系。方法:1)1ug/ml Pg-LPS刺激小鼠成骨样细胞MC3T3-E1 24h后,给细胞施加8%牵张应力8h,采用CCK8技术检测细胞的增殖活性,通过Hoechst 33258染色观察细胞的凋亡,鬼笔环肽染色观察细胞的骨架变化。2)1ug/ml Pg-LPS刺激小鼠成骨样细胞MC3T3-E1 24h,施加8%牵张力8h,使用Western Blot技术分化的研究检测细胞内RhoA、ROCK、Runx-2的蛋白表达变化,qRT-PCR技术检测细胞内RhoA、ROCK、Runx-2的基因表达变化。3)1ug/ml Pg-LPS刺激小鼠成骨样细胞MC3T3-E1 24h,使用0.5ng/ml的C3转移酶抑制RhoA/ROCK信号通路后,给细胞施加8%牵张力8h,使用Western blot、qRT-PCR技术检测细胞内RhoA、ROCK、Runx-2在蛋白和基因水平的表达,并与RhoA/ROCK信号通路抑制前细胞内RhoA、ROCK、Runx-2的表达进行对比。结果:1)Pg-LPS刺激成骨细胞24h后,细胞增殖率明显降低,并且凋亡细胞的数目显著增多。Pg-LPS刺激细胞24h,给细胞施加8%牵张力8h,细胞活性增强,细胞凋亡数目减少,但仍低于未Pg-LPS刺激组,给细胞施加牵张力后,紊乱无序的肌动蛋白纤维沿细胞轴有序排列。2)给细胞施加8%牵张力8h,细胞内RhoA、ROCK、Runx-2在蛋白和基因水平均升高。细胞加入C3转移酶处理后,施加8%牵张力8h,细胞内RhoA、ROCK、Runx-2在蛋白和基因水平均降低。3)Pg-LPS刺激成骨细胞24h后,细胞内RhoA、ROCK、Runx-2在蛋白和基因水平均降低,给细胞施加8%牵张力8h后,细胞内RhoA、ROCK、Runx-2在蛋白和基因水平均有所升高,但仍低于正常对照组。Pg-LPS刺激成骨细胞24h,细胞抑制剂处理后,施加8%牵张力8h,细胞内RhoA、ROCK表达降低,Runx-2表达升高。结论:一定的机械牵张力对Pg-LPS诱导的细胞凋亡具有保护作用,RhoA/ROCK信号通路对Pg-LPS诱导的抑制细胞分化具有调控作用,并且对成骨细胞的成骨作用产生影响。