论文部分内容阅读
3-羟基丙酸(3-Hydroxypropionic acid,3-HP)作为重要的化工产品前体,有广阔的市场前景。肺炎克雷伯氏菌含有独特的dha调节子,能以甘油为底物发酵生产3-HP,整体代谢通路清晰,但通路中一些关键酶的重要作用以及酶之间的相关性仍需进一步探究。本论文主要研究肺炎克雷伯氏菌以甘油为底物代谢途径中的三个关键酶：甘油脱氢酶(DhaD)、醛脱氢酶(AldH)和1,3-丙二醇氧化还原酶(DhaT),对3-羟基丙酸产量的影响。1、甘油脱氢酶(DhaD)：本研究首次证明肺炎克雷伯氏菌中dha调节子具有氧化还原平衡刚性,过表达氧化途径的第一个关键酶：甘油脱氢酶(dhaD编码),构建菌体K.p(pET-PK-dhaD)。通过摇瓶发酵,初步证明加强氧化途径可以同步提高还原途径的3-HP产量,与野生型相比提高了60%,达到1.68 g/L。酶活测定结果表明,过表达甘油脱氢酶,不仅提高了其酶活,且同时提高了还原途径的甘油脱水酶(DhaB)的活力,证明了菌体中dha调节子存在氧化与还原途径的平衡刚性,此结论充分说明歧化途径“此消彼长”的概念具有局限性,传统的机械性敲除旁路,太过片面；要结合菌体本身结构的特殊性以及整体性进行途径改造。2、醛脱氢酶(DhaS)：本研究发现一种来自枯草芽孢杆菌中全新的醛脱氢酶,首次将其应用到提高3-HP的产量中,构建工程菌K p(pET-PK-dhaS)。通过摇瓶发酵,初步确定该酶对提高3-HP产量的重要作用,产量提高3.9倍。经过底物专一性和辅酶选择性的实验鉴定,确定该酶对3-羟基丙醛有很强的底物专一性且以NAD+为辅酶。并通过分子模拟对该酶进行结构预测,从理论上证明了该酶是以NAD+为辅酶的醛脱氢酶。之后进行了上罐放大生产,3-HP达到理想产量,说明该基因在放大生产中有明显作用。综上所述,探究一种全新的醛脱氢酶,要将基础研究和应用价值相结合,共同探究该酶的研究意义。3、1,3-丙二醇氧化还原酶(DhaT)：为了证明DhaT的重要作用,将过表达dhaT基因的工程菌K.p(pET-PK-dhaT)和敲除dhaT的工程菌K.p△dhaT(pET-PK)以及含有空质粒的对照菌K.p(pET-PK),在5个不同的转速下进行发酵,研究菌体生长和代谢产物的变化情况,结果证明dhaT基因对以甘油为底物的代谢至关重要,且dhaT是dha调节子中控制着菌体氧耗条件的关键基因。因此,研究背景为含有dhaT的肺炎克雷伯氏菌,需要考虑底物的选择与氧耗条件以及代谢途径的整体控制。