研究背景乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)是嗜肝DNA病毒属的一员。HBV可以引起肝脏的急、慢性感染,HBV的慢性感染是引起严重肝脏疾病的主要病因。据世界卫生组织报道,全球20多亿人曾感染乙肝病毒,其中3.5亿以上为慢性乙型肝炎病毒感染者。慢性乙型肝炎不易彻底治愈,并且具有发展成肝硬化、肝癌的高度危险性。慢性乙型肝炎(CHB)是一个严重的公共卫生问题,每年全世界范围内约有一百万人死于慢性乙型肝炎感染所致的肝衰竭、肝硬化和肝细胞肝癌。我国约有超过50%的居民曾被乙型肝炎病毒感染过,其中8%-15%的人成为慢性感染者。慢性乙型肝炎(CHB)治疗的目标是要实现的持续抑制HBV的复制,缓解肝脏疾病。乙型肝炎的治疗取决于几个因素,如疾病的阶段,“e”抗原的存在或缺失、耐药性、特别是在肝脏慢性疾病的终末期后期无有效药物治疗。因此,在治疗时机的选择及治疗过程中对以上因素的评价是非常重要的。干扰素a-2a(IFN2a)和干扰素α-2b干扰素(IFN2b)作为首选的治疗CHB已使用多年,治疗的目标是HBeAg血清转换,以激活免疫反应,改变免疫状态,目的是清除乙肝病毒DNA (HBVDNA)缓解疾病。然而,治疗费用昂贵且有许多副作用,如贫血、血红蛋白下降、恶心、呕吐,出冷汗等。而且仅约1/3患者用α-干扰素治疗持续应答。此外,核苷类似物不能完全消除病毒,并可能导致病毒基因突变。因此,开发新的抗病毒治疗药物仍然是一个重大的科研任务。但由于缺乏合适的HBV感染细胞模型或小动物模型来评价新的治疗策略而使CHB的治疗受到阻碍。目前,HepG2.2.15细胞系是最常用的体外研究HBV的细胞模型,HepG2.2.15细胞系作为公认的HBV全基因稳定表达细胞系,能支持HBV的复制,分泌感染性病毒颗粒。但因病毒基因以较为固定的拷贝数整合于宿主细胞染色体,表达水平低,其作为体外HBV感染细胞模型,尤其是作为抗病毒药物筛选和研究耐药突变株生物学特征的感染模型,受到了一定的局限。目前仍然迫切需要建立一个体外细胞培养或试验动物模型来帮助我们理解HBV感染中病毒-宿主相互作用,确定病毒突变体的致病性,检测新的抗病毒药物和对慢性感染治疗方法的选择。应用病毒基因的转导使细胞永生化是建立连续传代细胞系的一种方法。将SV40早期转录区基因导入细胞内是最常用的细胞永生化的方法,几乎适用于各种人类细胞类型。通过对SV40T基因介导的永生化细胞系的深入研究,多数研究结果显示SV40T基因的导入除提高转化细胞的生长速率外,能保留其原始细胞的许多分化表型,而非原始基因的表达很少见,在细胞水平上可反映其原始细胞的生物学特性,可作为体外研究的模型。1.3拷贝HBVDNA质粒含HBV完整复制体,基因组小于2.0拷贝,且复制和表达效率高于1.2和1.1拷贝,包含了HBV5’末端Enh Ⅰ、Enh Ⅱ,复制起始区(DR1、DR2)、前基因组转录起始位点x和前C区启动子,x开放读码框等,所以应用的最多。本研究的目的是构建SV40T永生化小鼠肝细胞系,观察1.3倍全基因HBV真核细胞表达质粒(pHBV1.3)在其细胞中的表达。希望能建立一种新型的HBV体外细胞模型。第一部分SV40T永生化小鼠肝细胞系的建立[目的]建立SV40T永生化小鼠肝细胞系,以作为后续实验研究的基础。[方法]1、建立SV40T永生化小鼠肝细胞系。1.1、原代小鼠肝细胞的分离与培养。1.2、SV40T基因质粒(pRSV-T)扩增及抽提。1.3、利用脂质体lipofectamine2000介导pRSV-T质粒转染原代培养小鼠肝细胞。2、SV40T永生化小鼠肝细胞系的检测。2.1、SV40T抗原检测：通过间接免疫荧光法检测SV40T抗原在小鼠肝细胞内的分布情况。2.2、形态学观察：在倒置相差显微镜下观察原代鼠肝细胞和SV40LT抗原永生化小鼠肝细胞的形态,同时在电子显微镜下对两种细胞进行超微结构观察。2.3、绘制原代及SV40T永生化小鼠肝细胞生长曲线,了解细胞生长周期。2.4、生化检测：测定原代及SV40T永生化小鼠肝细胞培养上清液中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、甲胎蛋白(AFP)的含量。2.5、RT-PCR检测肝细胞系中ALB-mRNA的表达。2.6、免疫印迹法(Western blot)检测转染细胞CK-18的免疫反应性。[结果]1、原代小鼠肝细胞的培养和转染：直接胶原酶消化法分离的肝细胞培养后,倒置相差显微镜下原代小鼠肝细胞形态扁平、呈多边形、通常多个细胞成串簇状排列,细胞呈单层贴壁、铺满瓶底。原代培养小鼠肝细胞经脂质体转染SV40L T抗原和50μ g/ml氨苄青霉素(Amp)筛选,于转染后30天出现一明显的上皮细胞样抗Amp的阳性克隆细胞。其余脂质体组和空白对照组细胞已大多死亡。2、SV40T抗原检测：转染后SV40T抗原免疫荧光逐渐增强,至转染后30天时可见明显荧光。胞浆内呈磨砂样荧光,细胞核内呈颗粒状荧光。3、转染肝细胞形态：原代及转染小鼠肝细胞均呈单层贴壁生长,形态呈上皮细胞样,原代小鼠细胞增殖缓慢,传代一次需7-9d。永生化小鼠肝细胞增殖明显比原代快,传代一次只需4-5d。在电子显微镜下,转染肝细胞与正常原代培养小鼠肝细胞相比无明显差异,呈典型的肝细胞形态与结构,细胞内丰富的糖原颗粒和大量的线粒体以及内质网结构清晰可见；细胞膜外可见典型的微状突起物；正在进行分裂的双核仁细胞体现了转染肝细胞体外增殖分化的过程。4、细胞生长曲线：在含10%的胎牛血清培养基中原代小鼠肝细胞生长缓慢,原代小鼠肝细胞在接种后第7天细胞增殖减缓。第8天开始出现细胞死亡。转化后的细胞于接种后第3-4日起增殖减缓,第5天开始出现细胞死亡。5、生化检测：原代及SV40T永生化小鼠肝细胞培养液上清液中ALT、AST、AFP的含量变化差异无显著性(P>O.05)。6、RT-PCR检测转染肝细胞中ALB mRNA的表达：对原代和转染小鼠肝细胞进行总RNA抽提和一步法RT-PCR扩增ALB-mRNA,结果2个标本在475bp处均出现明亮条带,表明转染肝细胞具有表达ALB mRNA的能力。7、Wostern blot检测原代、转染小鼠肝细胞角蛋白18(CK-18)免疫反应性：对原代、转染小鼠肝细胞进行蛋白质提取,经SDS-PAGE、Western blot检测,目的条带细胞CK-18显色均呈阳性,表明原代、转染肝细胞均具有CK-18免疫反应性。[结论]1、pRSV-T质粒可以使小鼠肝细胞永生化,建立SV40T永生化小鼠肝细胞系。2、SV40T永生化小鼠肝细胞系具有原代小鼠肝细胞形态、生长特性及功能,且在体外可以传代培养。可以进一步用来研究建立适宜于HBV感染的细胞模型。到目前为止,经过了五年多的冻存复苏和传代培养,SV40T永生化小鼠肝细胞已经传代50代次,传代、复苏和冻存不改变细胞的形态及增殖能力,细胞形态和生长特性没有明显改变。第二部分pHBV1.3质粒在SV40T永生化小鼠肝细胞系的表达[目的]观察pHBV1.3质粒在SV40T永生化小鼠肝细胞系的表达,希望能建立一种新型的HBV体外细胞模型。[方法]1、pHBV1.3质粒转染SV40T永生化小鼠肝细胞系：按脂质体转染试剂盒lipofectamine2000说明将pHBV1.3质粒转染SV40T永生化小鼠肝细胞系22代。2、pHBV1.3质粒在永生化小鼠肝细胞中的表达2.1、HBsAg及HBeAg的检测：用Abbott的AXSYM自动免疫分析仪及其配套的微粒子酶免分析法(MEIA)诊断试剂盒对转染细胞上清液进行HBsAg、HBeAg检测。2.2、间接免疫荧光检测细胞内HBsAg、HBcAg的表达：将SV40T永生化鼠肝细胞系22代细胞接种于24孔板,转染后24、48、72h用PBS洗涤细胞,4%多聚甲醛固定,按试剂盒说明进行免疫荧光检测,兔抗一HBc以1：500稀释,鼠抗一HBs1：50稀释。2.3、Southern blot:提取转染后72h细胞内总DNA并纯化。将纯化的DNA样本点样于1%琼脂糖凝胶上电泳后,转移至硝酸纤维素膜上与地高辛标记的3.2KB全长HBVDNA探针杂交。地高辛标记及Southern试剂盒购于罗氏,方法按说明进行。2.4、透射电镜检测pHBVl.3质粒转染小鼠肝细胞培养液中HBV病毒颗粒：收集转染后72小时培养上清液,280000×g,4℃超速离心5小时弃去上清,沉淀用100μ L TN缓冲液溶解混匀。滴于有支持膜(0.3%Formvar)的铜网上,2%磷钨酸负染2分钟,室温中干燥30分钟,JEOL透射电镜(JEM-1200EX Electron Microscope)观察,拍照。[结果]1、转染24h后,细胞上清液中可检出HBsAg、HBeAg,72h达到高峰,96h呈下降趋势。转染细胞传代后细胞上清液中HBsAg、HBeAg呈下降趋势。传代至第4代时HBsAg、HBeAg均为阴性。2、转染24小时后,有HBsAg和HBcAg阳性细胞出现,72h细胞表达最强。HBsAg主要呈胞浆内弥漫性分布,HBcAg为核浆型分布,以浆型为主。3、Southern杂交检测转染细胞内HBVDNA的复制：转染后72h,转染细胞中存在3.5KB、2.4KB、2.1KB病毒复制中间体。4、电镜结果：收集转染后72小时细胞培养上清,超速离心后,沉淀用2%磷钨酸负染,JEM-1200EX透射电镜观察。电镜下可以见到少量直径42nm的双层壳状Dane颗粒和较多的直径22nm的小球型颗粒及少量丝状颗粒。[结论]经SV40T抗原转染的小鼠肝细胞系可以被pHBV1.3质粒二次转染,转染后HBV可以在SV40T抗原转染的永生化小鼠肝细胞内进行病毒基因的复制,形成病毒复制中间体。并且进一步进行病毒基因的表达,合成HBV特异性蛋白HBsAg、 HBeAg和HBcAg; pHBV1.3质粒转染后永生化小鼠肝细胞能合成子代病毒颗粒并分泌出细胞。总结本研究结果证实,pRSV-T质粒可以使小鼠肝细胞永生化,建立SV40T永生化小鼠肝细胞系。SV40T永生化小鼠肝细胞系具有原代小鼠肝细胞形态和生长特性,且在体外可以传代培养。且可以被pHBVl.3质粒二次转染,转染后乙型肝炎病毒可以在SV40T抗原转染的永生化小鼠肝细胞内进行病毒基因的复制,形成ssDNA、dsDNA和rcDNA病毒复制中间体,且进一步进行病毒基因的表达,合成HBV特异性蛋白HBsAg、HBeAg和HBcAg；pHBV1.3质粒转染后永生化小鼠肝细胞能合成子代病毒颗粒并分泌出细胞。SV40T永生化小鼠肝细胞可以作为一个新型的适宜于HBV瞬时转染的细胞模型,为体外抗病毒药物筛选提供新的细胞模型。观察了HBVDNA在小鼠肝细胞内的复制情况,为建立人HBVDNA转染跨种属肝细胞模型奠定基础。