【摘 要】
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刺吸式昆虫唾液腺分泌的蛋白质不同程度参与了寄主营养物质的吸取与消化、植物防御机制的抵抗与抑制以及植物次生有害物质的氧化和分解。唾液腺也是病原体离开介体进入寄主植物前的最后一个“战场”。因此,对唾液腺的生理研究是探索病原生物——介体昆虫——寄主植物互作机制的最重要的环节。小麦矮缩病毒(WDV)是小麦矮缩病的病原物,以持久循环非增殖方式利用条沙叶蝉Psammotettix striatus(Linna
【基金项目】
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国家自然科学基金(31572306、31772514);
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刺吸式昆虫唾液腺分泌的蛋白质不同程度参与了寄主营养物质的吸取与消化、植物防御机制的抵抗与抑制以及植物次生有害物质的氧化和分解。唾液腺也是病原体离开介体进入寄主植物前的最后一个“战场”。因此,对唾液腺的生理研究是探索病原生物——介体昆虫——寄主植物互作机制的最重要的环节。小麦矮缩病毒(WDV)是小麦矮缩病的病原物,以持久循环非增殖方式利用条沙叶蝉Psammotettix striatus(Linnaeus)传播,条沙叶蝉的唾液腺在WDV——条沙叶蝉——禾本科作物互作中具有重要的作用,但其功能尚不明确。本文对WDV侵染前后的条沙叶蝉唾液腺进行转录组测序分析,取得如下成果:通过Illumina HiSeq测序、Trinity拼接、Corset层次聚类,共获得366,352条高质量的Unigene序列,平均长度为707 bp,N90为309bp。其中有32l,407条来自未感染的唾液腺,有302,062条来自受感染的唾液腺。161,458条Unigene可以被至少一种数据库(Nr、Nt、KO、Swiss-Prot、Pfam、GO、KOG)功能注释。GO、KOG分类以及KEGG代谢通路结果表明,参与生物代谢和信号转导的基因出现频率最高。NR注释结果中存在许多在植食性昆虫中热点研究的酶类基因。预测得到2,294个分泌蛋白,主要包括降解细胞壁的果胶裂解酶、β-葡聚糖内切酶、几丁质酶;降解细胞膜的脂肪酶;参与消化的α-淀粉酶;参与昆虫先天性免疫反应的过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、过氧化物酶;具有解毒活性的羧酸酯酶、细胞色素P450和谷胱甘肽S-转移酶;结合植物内Ca2+和凝集素的钙结合蛋白、氨基肽酶。对WDV侵染前后差异基因的筛选和富集分析,共发现31,751条差异基因,其中上调的有898条,显著富集于钙离子的结合;下调的有30,853条,显著富集于代谢过程和催化活动。通过对这些差异基因的功能分析,发现WDV侵染后部分蛋白的表达水平发生变化,其中9个钙结合蛋白、5个氨基肽酶、1个羧肽酶和6个脂肪酶的基因表现上调;而3个丝氨酸蛋白酶、2个半胱氨酸蛋白酶、2个葡萄糖苷酶、3种细胞色素P450、1种羧酸酯酶和1种超氧化物歧化酶的基因表现为下调。另外,6个参与DNA复制和RNA修饰的基因在感染WDV的条沙叶蝉唾液腺中被显著抑制。差异基因的变化趋势不仅利于WDV侵染条沙叶蝉唾液腺,还可以帮助病毒顺利沿着唾液顺利进入植物体内,实现对寄主的侵染过程。对条沙叶蝉的6个持家基因进行内参基因的筛选,其中包括泛素结合酶UBC、肌动蛋白ACT、18S RNA、β-微管蛋白B-TUB、核糖体蛋白RPS23、甘油醛-3-磷酸脱氢酶GADPH。利用Best Keeper、Norm Finder、GeNorm和Refinder分析软件验证这些候选内参基因在条沙叶蝉不同组织和WDV侵染前后的稳定性,确定GAPDH、RPS23、18S作为测定在条沙叶蝉不同组织上目的基因相对表达量的内参基因;测定WDV侵染前后目的基因相对表达量的内参基因稳定性UBC>18S>B-TUB>GADPH>ACT>RPS23。通过qRT-PCR对感染WDV前后唾液腺、条沙叶蝉不同组织中显著差异的15条基因进行相对定量分析发现,定量结果与转录组差异性分析所得到的结果是吻合的,说明本实验转录组数据分析结果具有参考价值。此外,我们还发现钙结合蛋白、氨基肽酶脂肪酶和α-淀粉酶基因在唾液腺中表达量显著高于其它组织,说明这些基因是唾液腺特异表达的基因,且受WDV侵染的影响较大;细胞色素P450、DNA复制许可因子和超氧化歧化酶虽然在条沙叶蝉唾液中也受WDV侵染影响,但这些基因并不仅局限于唾液腺表达。此外,我们还对取食毒株不同时间WDV-CP、CBP、SOD在唾液腺中的相对表达量进行检测。结果表明,取食过程一开始唾液腺中WDV的含量便迅速升高并在20min后达到相对稳定;1h后CBP、SOD的表达量开始分别上调和下调并在48h后开始稳定。本研究推测在条沙叶蝉取食和传毒过程中发挥作用的潜在蛋白分子,为以后开展条沙叶蝉、寄主植物与病原生物三者互作的研究提供宝贵线索和理论依据。
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