论文部分内容阅读
研究背景及目的:上皮性卵巢癌是妇科恶性肿瘤中死亡率最高的肿瘤,主要原因是大多数患者确诊时已发展为疾病的晚期,伴随腹膜种植和远处转移。尽管近年来卵巢癌的治疗已经取得了很大进展,但是卵巢癌患者的高复发率和高转移率使其预后并未得到明显改善。在深入理解卵巢癌转移的分子机制的基础上,寻找可以抑制其转移的药物,对提高卵巢癌治疗的有效率、改善其预后是十分必要的。上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是一种发育调控性程序,在胚胎发育、器官形成、伤口愈合等生理过程中发挥重要作用。近年来,在乳腺癌、肝癌、卵巢癌等研究中发现,上皮性癌细胞模拟此过程后,即可获得多种侵袭和迁移的能力,提示EMT与癌症的侵袭和转移密切相关。因此,寻找阻断EMT的药物具有潜在的临床意义。盐霉素是一种单羧基聚醚类抗生素,广泛地用于鸡的抗球虫病治疗。在乳腺癌的研究中发现盐霉素能够靶向杀灭乳腺癌干细胞。EMT与细胞获得干性的密切关系提示我们EMT可能是盐霉素靶向抑制干细胞的主要作用机制。近年来,盐霉素抑制EMT的能力在肝癌、结肠癌、肺癌中被证实,但在卵巢癌中尚未见报道。本文旨在研究盐霉素对人上皮性卵巢癌细胞系A2780和SK-OV-3增殖、侵袭、迁移等能力的影响并对其作用机制进行初步的探讨。方法:CCK-8法检测不同浓度盐霉素(0,2,4,8,16μM)作用不同时间后A2780和SK-OV-3细胞的生存率。Transwell侵袭小室检测盐霉素对A2780细胞和SK-OV-3细胞侵袭和迁移能力的影响。Western-blot和RT-PCR检测盐霉素作用前后A2780和SK-OV-3细胞中上皮表型分子E-cadherin和Keratin,间质表型分子N-cadherin和Vimentin以及Wnt/β-catenin信号通路相关分子表达的变化。免疫荧光方法用来定位P-catenin在卵巢癌细胞中的分布;GSK-3β抑制剂(SB216763)用来激活卵巢癌细胞中的Wnt/β-catenin信号通路。结果:(1)盐霉素对卵巢癌细胞的增殖能力有抑制作用:应用CCK-8法检测不同浓度盐霉素(0,2,4,8,16μM)作用于A2780和SK-OV-3细胞24,48,72小时后细胞的生长率,结果显示:盐霉素对这两种细胞均有抑制增殖的作用,且呈时间依赖性和浓度依赖性。(2)盐霉素对卵巢癌细胞的侵袭和迁移能力有抑制作用:应用Transwell小室检测盐霉素作用前后A2780和SK-OV-3细胞侵袭和迁移能力的改变,结果显示:与对照组相比,盐霉素处理后的卵巢癌细胞的侵袭能力和迁移能力均明显下降(P<0.001)。(3)盐霉素对卵巢癌细胞发生EMT有抑制作用:应用Western-blot和RT-PCR方法检测盐霉素对A2780和SK-OV-3细胞上皮性分子E-cadherin、Keratin和间质性分子N-cadherin、Vimentin表达的影响,结果显示:与对照组相比,经盐霉素处理的卵巢癌细胞的上皮性分子表达明显升高,而间质性分子表达明显下降,且随着药物浓度的增加变化越明显。(4)盐霉素对卵巢癌细胞中Wnt/β-catenin信号通路有阻断作用:应用Western-blot和RT-PCR方法检测盐霉素作用前后Wnt/β-catenin信号通路相关分子β-GSK-3β-ser9、β-catenin、slug、Axin2、CCND1的表达,结果显示:与对照组相比,实验组中各分子的表达随着药物浓度的增加逐渐下降;用免疫荧光方法定位盐霉素作用前后β-catenin在卵巢癌细胞中的分布,结果显示:与对照组相比,实验组中细胞内的β-catenin大部分集中于胞浆内,在胞核内的分布明显减少。(5)盐霉素抑制卵巢癌细胞发生EMT的机制研究:GSK-3β抑制剂(SB216763)处理后,Wnt/β-catenin信号通路各相关分子表达均上调,同时我们检测EMT相关蛋白发现,在两个细胞系中,上皮表型分子均表达下调且间质表型分子表达上调;我们将盐霉素作用于SB216763预处理后的细胞,发现Wnt/β-catenin信号通路各相关分子的表达较SB216763单一处理后的细胞下调。结论:(1)盐霉素通过抑制上皮性卵巢癌细胞发生EMT而抑制其侵袭和迁移能力。(2)盐霉素抑制上皮性卵巢癌细胞发生EMT是通过抑制Wnt/β-catenin信号通路完成的。